Resumo
As fosfolipases A2 endógenas desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória, em desordens neurodegenerativas, na apoptose e na senescência celular. Neurotoxinas com atividade de fosfolipase A2 (FLA2) (beta-neurotoxinas) são encontradas em venenos de serpentes das famílias Elapidaee Viperidae e podem levar à morte neuronal. Modelos de neurônios em cultura têm sido utilizados para caracterizar o mecanismo de ação dessas toxinas. Poucos trabalhos foram realizados utilizando as células gliais como modelo. As células da glia, em particular os astrócitos, são células que, diferentemente dos neurônios, permanecem com capacidade de proliferação e são essenciais na homeostasia e na defesa contra eventos patológicos que podem ocorrer no sistema nervoso central. Além disso, os astrócitos fazem parte das sinapses, e quando ativados por neurotransmissores, liberam gliotransmissores que modulam a transmissão sináptica. Os mecanismos de neurotoxicidade das toxinas FLA2 não estão totalmente esclarecidos e podem estar relacionados com a sua atividade enzimática, com a interação com um receptor próprio ou processos de internalização e até mesmo interação direta com a mitocôndria. O objetivo deste trabalho é caracterizar as ações de duas toxinas fosfolipásicas A2 isoladas do veneno da serpente Micrurus lemniscatus, Mlx-8 e Mlx-9, sobre a viabilidade, proliferação celular, fases do ciclo celular, indução de apoptose em astrócitos em cultura, além de investigar as vias de sinalização intracelulares envolvidas nos efeitos observados. A proliferação, as fases do ciclo celular e a viabilidade celular serão avaliadas por citometria de fluxo e ensaio de MTT. A liberação de TNF-alfa e a ativação do NFkB serão analisadas por imunoensaios. A apoptose será avaliada pela fragmentação do DNA, pela Anexina-V e pela expressão protéica de Bcl2, Bax, caspases 3 e 8 e Hsp-70. Será avaliada também a expressão proteica e do RNAm dos marcadores de proliferação: p53, p21, p27, Ki67e das ciclinas A e D, bem como do receptor PLA2R e da MAPK. A viabilidade e integridade mitocondrial serão analisadas através da determinação do potencial de membrana mitocondrial e da marcação com o fluorocromo rodamina-123. O estresse oxidativo será avaliado pela quantificação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio por fluorimetria. Por fim, a internalização das toxinas na célula será analisada pela sua marcação com o fluoróforo Alexa-488 ou Alexa-568 e observação em microscopia confocal. (AU)