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Hiperglicemia e migração de fibroblastos em matrizes extracelulares 3-D, composição e remodelação da matriz - potencial regulação por microRNAs 31, 196a e 29b

Processo: 15/19645-7
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de dezembro de 2016 - 31 de maio de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Morfologia - Citologia e Biologia Celular
Pesquisador responsável:Marinilce Fagundes dos Santos
Beneficiário:Marinilce Fagundes dos Santos
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Pesq. associados:Cilene Rebouças de Lima
Assunto(s):Matriz extracelular  Diabetes mellitus  Fibroblastos  MicroRNAs  Movimento celular 

Resumo

A cicatrização deficiente é uma das complicações mais comuns da hiperglicemia (HG) e está associada à microangiopatia, neuropatia e alterações funcionais de fibroblastos. Alguns estudos utilizando fibroblastos obtidos de pacientes diabéticos, ou fibroblastos cultivados em condições que simulam a HG, demonstraram alterações na proliferação celular e síntese de proteínas da MEC. Poucos estudos, no entanto, abordaram os efeitos da HG sobre a migração destas células, sobre as propriedades físicas da MEC e sobre a sua renovação. Estudos prévios deste grupo mostraram que fibroblastos derivados da derme de ratos diabéticos ou expostos in vitro a uma elevada concentração de glicose migram menos sobre substratos bidimensionais (2-D) constituídos por fibronectina ou colágeno I. Nestas condições as células apresentam velocidade e direcionalidade reduzidas, maior número de protrusões celulares simultâneas e não produtivas (retráteis) e menor amadurecimento das adesões celulares junto à MEC. Estes efeitos foram revertidos na presença do antioxidante N-acetilcisteína (NAC). Não estão esclarecidos, no entanto, os efeitos da HG sobre a migração de fibroblastos em ambientes tridimensionais (3-D), assim como seus efeitos sobre a síntese de MEC. Recentemente, microRNAs (miRs) foram demonstrados como importantes moduladores da migração celular (miR-31, p.ex.) e da síntese de MEC (miR-196a e miR-29b, p.ex.). Nós demonstramos previamente que a expressão de miR-31 aumentou cerca de 3 vezes em fibroblastos obtidos de animais diabéticos, quando comparados com fibroblastos de animais controle. Em fibroblastos NIH-3T3, a HG aumentou a expressão de miR-31 em 50% após 3 dias de exposição. Nestas células, o tratamento com o antioxidante NAC preveniu o aumento do miR-31, mantendo-o em níveis normais, e evitando o aumento no número de protrusões não efetivas. A expressão de miR-31 exógeno em NIH-3T3 aumentou o número de protrusões celulares improdutivas e simultâneas e reduziu a direcionalidade das células, sem afetar a velocidade celular. Uma hipótese deste projeto é que a glicose elevada regula a expressão de miR-31 através da geração de espécies reativas de oxigênio. Este miR, por sua vez, regula negativamente a expressão de proteínas importantes para o processo de migração celular. Outros miRs potencialmente relevantes que regulam a MEC, como miR-196a e miR-29b, alterados durante a fase final de remodelação da MEC na cicatrização cutânea de diabéticos, também podem ser menos expressos em fibroblastos, alterando a proporção colágeno III/colágeno I e fibronectina. Assim, este estudo tem por objetivos principais: 1) em fibroblastos NIH-3T3, avaliar a expressão de alvos do miR-31 (miR-31-5p), preditos por Bioinformática, que possam ser responsáveis pelo fenótipo observado nestas células mantidas sob glicose elevada: RhoA, Radixina, Rock1, Rock2, integrinas ±v e ±5. Validar estes alvos por meio de ensaios de luciferase e, em células expostas à glicose elevada, inibir a expressão de miR-31-5p com antagomiR e avaliar uma possível reversão (provavelmente parcial) do fenótipo migratório e 2) utilizando fibroblastos derivados da pele humana, avaliar os efeitos da glicose elevada sobre a migração celular em ambientes tridimensionais (3-D) e sobre a produção e remodelação da MEC. Será feita uma análise da expressão de moléculas de matriz extracelular e de adesão por RT PCR Array (84 genes). Serão utilizadas culturas 3-D em MEC derivada de células (MDC) e géis de colágeno I/fibronectina. Na MDC, alterações da composição bioquímica e da organização promovidas pela glicose também serão avaliadas. Proteoglicanos e glicosaminoglicanos (inclusive ácido hialurônico) serão analisados. A potencial regulação da MEC por microRNAs miR-196a e miR-29b será avaliada nas culturas, tanto em células quanto no meio extracelular (microvesículas secretadas). (AU)

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
MONTEIRO, MARIANA M.; LIMA, CILENE R.; GOMES, CIBELE C.; CRUZ, MARIO C.; HORLIANA, ANNA C. R. T.; SANTOS, MARINILCE F. Lowered Expression of MicroRNAs 221 and 222 Mediate Apoptosis Induced by High Glucose in Human Periodontal Ligament Cells. Cell Biochemistry and Biophysics, v. 78, n. 3, SI JUL 2020. Citações Web of Science: 0.
LIMA, CILENE REBOUCAS; GOMES, CIBELE CRASTEQUINI; SANTOS, MARINILCE FAGUNDES. Role of microRNAs in endocrine cancer metastasis. Molecular and Cellular Endocrinology, v. 456, n. C, SI, p. 62-75, NOV 15 2017. Citações Web of Science: 23.

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