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Pegilação N-terminal de proteínas e purificação por sistemas aquosos bifásicos

Processo: 16/22065-5
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de abril de 2017 - 31 de dezembro de 2019
Área do conhecimento:Engenharias - Engenharia Química - Processos Industriais de Engenharia Química
Pesquisador responsável:Carlota de Oliveira Rangel Yagui
Beneficiário:Carlota de Oliveira Rangel Yagui
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Purificação de proteínas  Sistema de duas fases aquosas 

Resumo

Os medicamentos biológicos representam um grande avanço realizado pela indústria farmacêutica, que gerou receitas consideráveis para as companhias detentoras das patentes das moléculas inovadoras inseridas recentemente no mercado. Entretanto, a necessidade econômica de permanecer competitivo no mercado e de solucionar os problemas intrínsecos de biofármacos proteicos como imunogenicidade e instabilidade biológica levou ao aprimoramento de fármacos biotecnológicos existentes, surgindo então os biobetters. Nesse contexto, uma das técnicas mais empregadas atualmente para obtenção de biofármacos, incluindo biobetters, consiste na ligação covalente de cadeias de poli(etileno glicol) (PEG). Essa técnica, também conhecida como peguilação, permite o aprimoramento tanto farmacocinético quanto farmacodinâmico de biofármacos, em especial aqueles de natureza proteica. Nesse projeto, pretendemos estudar a peguliação sítio específica N-terminal de diversas proteínas (BSA, catalase, L-asparaginase e lisozima), bem como a utilização de sistemas de duas fases aquosas para purificação das proteínas peguiladas das moléculas de proteína que não reagirem. Inicialmente, será estudada a reação com a proteína BSA, de maneira a definir as melhores condições de monopeguilação. Será estudada a influência da força iônica variando-se a molaridade do tampão PBS (0,01, 0,1 ou 0,2 M), a influência da proporção PEG:Proteína (25:1 ou 50:1) e a influência do pH (6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0) no rendimento da reação e estabilidade proteica. Definidas as condições acima, investigaremos o tempo reacional que forneça a menor taxa de polidispersão (por ligação do PEG em sítios inespecíficos). Em seguida, as proteínas peguiladas serão purificadas por cromatografia de troca iônica e exclusão molecular. A partição das proteínas monopeguiladas em sistemas de duas fases aquosas PEG/fosfato de potássio será investigada, empregando-se PEG de diferentes massas moleculares e diferentes composições de tampão fosfato de potássio. Será investigada também a possibilidade de se utilizar a própria proteína peguilada como agente polimérico formador de fase em sistema PEG-proteína/fosfato de potássio. As melhores condições obtidas serão testadas com o meio reacional contendo a proteína peguilada, sem purificação prévia. Para as proteínas que forem enzimas (catalase, L-asparaginase e lisozima), estudaremos também a termodinâmica de desnaturação térmica da enzima peguilada em comparação com a forma não peguilada, assim como a termodinâmica da reação catalisada para as formas peguilada e não peguilada. (AU)

Matéria(s) publicada(s) na Agência FAPESP sobre o auxílio:
Processo alternativo purifica proteínas usadas como biossensores 

Publicações científicas (10)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
SANTOS, JOAO H. P. M.; BRUMANO, LARISSA P.; PESSOA, JR., ADALBERTO; RANGEL-YAGUI, CARLOTA O. Tailoring Protein PEGylation Reaction: An Undergraduate Laboratory Experiment. Journal of Chemical Education, v. 97, n. 5, p. 1443-1447, MAY 12 2020. Citações Web of Science: 0.
HERRERA BELEN, LISANDRA; DE OLIVEIRA RANGEL-YAGUI, CARLOTA; BELTRAN LISSABET, JORGE FELIX; EFFER, BRIAN; LEE-ESTEVEZ, MANUEL; PESSOA, ADALBERTO; CASTILLO, RODRIGO L.; FARIAS, JORGE G. From Synthesis to Characterization of Site-Selective PEGylated Proteins. FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, v. 10, DEC 18 2019. Citações Web of Science: 0.
SANTOS, JOAO H. P. M.; MENDONCA, CARLOS M. N.; SILVA, AMANDA R. P.; OLIVEIRA, RICARDO P. S.; PESSOA JR, ADALBERTO; COUTINHO, JOAO A. P.; VENTURA, SONIA P. M.; RANGEL-YAGUI, CARLOTA O. An integrated process combining the reaction and purification of PEGylated proteins. GREEN CHEMISTRY, v. 21, n. 23, p. 6407-6418, DEC 7 2019. Citações Web of Science: 0.
SANTOS, JOAO H. P. M.; FERREIRA, ANA M.; ALMEIDA, MAFALDA R.; QUINTEIRO, PAULA S. G. N.; DIAS, V, ANA C. R.; COUTINHO, JOAO A. P.; FREIRE, MARA G.; RANGEL-YAGUI, CARLOTA O.; VENTURA, SONIA P. M. Continuous separation of cytochrome-c PEGylated conjugates by fast centrifugal partition chromatography. GREEN CHEMISTRY, v. 21, n. 20, p. 5501-5506, OCT 21 2019. Citações Web of Science: 1.
SANTOS, JOAO H. P. M.; CARRETERO, GUSTAVO; VENTURA, SONIA P. M.; CONVERTI, ATTILIO; RANGEL-YAGUI, CARLOTA O. PEGylation as an efficient tool to enhance cytochrome c thermostability: a kinetic and thermodynamic study. JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B, v. 7, n. 28, p. 4432-4439, JUL 28 2019. Citações Web of Science: 1.
HERRERA BELEN, LISANDRA; BELTRAN LISSABET, JORGE; RANGEL-YAGUI, CARLOTA DE OLIVEIRA; EFFER, BRIAN; MONTEIRO, GISELE; PESSOA, ADALBERTO; FARIAS AVENDANO, JORGE G. A structural in silico analysis of the immunogenicity of L-asparaginase from Escherichia coli and Erwinia carotovora. BIOLOGICALS, v. 59, p. 47-55, MAY 2019. Citações Web of Science: 1.
TORRES-OBREQUE, KARIN; MENEGUETTI, GIOVANNA PASTORE; CUSTODIO, DEBORA; MONTEIRO, GISELE; PESSOA-JUNIOR, ADALBERTO; DE OLIVEIRA RANGEL-YAGUI, CARLOTA. Production of a novel N-terminal PEGylated crisantaspase. Biotechnology and Applied Biochemistry, v. 66, n. 3, p. 281-289, MAY-JUN 2019. Citações Web of Science: 1.
MENEGUETTI, GIOVANNA PASTORE; PICADO MADALENA SANTOS, JOAO HENRIQUE; TORRES OBREQUE, KARIN MARIANA; VAZ BARBOSA, CHRISTIANO MARCELLO; MONTEIRO, GISELE; POLISELLI FARSKY, SANDRA HELENA; DE OLIVEIRA, ADRIANO MARIM; ANGELI, CLAUDIA BLANES; PALMISANO, GIUSEPPE; MARQUES VENTURA, SONIA PATRICIA; PESSOA-JUNIOR, ADALBERTO; RANGEL-YAGUI, CARLOTA DE OLIVEIRA. Novel site-specific PEGylated L-asparaginase. PLoS One, v. 14, n. 2 FEB 12 2019. Citações Web of Science: 4.
PICADO MADALENA SANTOS, JOAO HENRIQUE; TORRES-OBREQUE, KARIN MARIANA; MENEGUETTI, GIOVANNA PASTORE; AMARO, BEATRIZ PANICHI; RANGEL-YAGUI, CARLOTA OLIVEIRA. Protein PEGylation for the design of biobetters: from reaction to purification processes. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 54, n. SI 2018. Citações Web of Science: 7.
SANTOS, JOAO H. P. M.; CARRETERO, GUSTAVO; COUTINHO, JOAO A. P.; RANGEL-YAGUI, CARLOTA O.; VENTURA, SONIA P. M. Multistep purification of cytochrome c PEGylated forms using polymer-based aqueous biphasic systems. GREEN CHEMISTRY, v. 19, n. 24, p. 5800-5808, DEC 21 2017. Citações Web of Science: 6.

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