Busca avançada
Ano de início
Entree

Células de pluripotência induzida para o estudo e tratamento de anemia falciforme

Processo: 17/06722-9
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
Vigência: 01 de julho de 2017 - 31 de dezembro de 2017
Área do conhecimento:Interdisciplinar
Pesquisador responsável:Elisa Maria de Sousa Russo
Beneficiário:Elisa Maria de Sousa Russo
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Células-tronco 

Resumo

A anemia falciforme (SC) é uma doença monogênica com alta mortalidade e morbidade. O único tratamento curativo para SCA é o transplante alogénico de células tronco hematopoiéticas (HSC), mas com várias complicações. O transplante de HSC representa a terapia celular mais bem sucedida realizada. Contudo, na prática clínica existem algumas limitações inerentes à sua disponibilidade e compatibilidade imunológica. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem originar qualquer tipo de célula e representar uma fonte alternativa para derivar células sanguíneas específicas do paciente. A tecnologia IPSC surgiu em 2006 como uma ferramenta poderosa para pesquisa básica, pesquisa de diferenciação tecidual e modelagem de doenças, e uma promessa de futuras aplicações clínicas para encontrar e pesquisar novas drogas mais eficazes e seguras, além da possibilidade de uso em medicina regenerativa na produção de células paciente-específicas para terapia celular. A ausência de um tratamento corretivo amplo, eficaz e seguro para anemia falciforme torna a tecnologia de iPSC muito atraente. Nesse contexto, nosso trabalho objetivou obter um modelo de estudo e tratamento definitivo para SCA utilizando a tecnologia iPSC. Para isso, foram utilizados dois plasmídeos epissomais que foram inseridos em células mononucleares de sangue periférico (MNC) para obter iPSC sem integração. As MNCs foram pré-cultivadas para enriquecimento da população de eritroblastos e depleção da população linfoide, o que foi bastante eficiente. Nesta pré-cultura, observou-se uma menor taxa de crescimento celular em doentes tratados com o fármaco hidroxiureia em comparação com os doentes não tratados, em que o crescimento celular tinha um aumento de 55% em relação ao percentual de células iniciais. As células expandidas que receberam os plasmídeos apresentaram as primeiras colônias de iPSC após cerca de 9 dias. Apos 15 dias de transfecção as colônias podiam ser retiradas. As linhagems de PBSCcd iPSC geradas foram caracterizadas quanto aos potencial de pluripotencia por citometria de fluxo, qPCR, imunocitoquímica e ensaio de fosfatase alcalina, e quanto ao potencial de diferenciação através da formação de corpos embrioides in vitro, predição do potencial de diferenciação por TaqMan Scorecard e ensaio in vivo de teratomas, avaliação por imunohistoquímica e HE. Esta caracterização foi realizada para a primeira linhagem gerada para a certificação do método. As linhagens seguintes foram caracterizadas por citometria de fluxo e formação de teratoma. Todas as linhagens geradas mostraram-se pluripotentes com potencial de auto-renovação e de formar células das 3 camadas germinativas. O rastreio dos vetores mostrou que após cerca de 10 passagens as células estão sem os mesmo livres ou integrados espontaneamente. As experiências iniciais de padronização da metodologia CRISPR serão utilizadas no futuro para corrigir a mutação de SCA. E a reação padronizada para a triagem da mutação na cadeia ²-globina poderia ser usada em futuras experiências de edição de genes na avaliação da correção de mutação. As células foram induzidas a diferenciar em HSC, de modo que obtivemos um protocolo dinâmico e eficiente com células CD34 (58%) e CD45 (77%) com apenas 8 dias de indução. Em suma, as iPSCs geradas oferecem um método mais seguro, o que reduz os riscos de integrações no genoma resultando em iPSCs mais adequadas para a modelagem eficiente de drogas e doenças. (AU)