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Caracterização das concentrações de hormônio anti-Mülleriano (AMH) em cadelas e lobas cinza (Canis lupus baileyi)

Processo: 17/06047-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de agosto de 2017 - 31 de julho de 2019
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Pesquisador responsável:Maria Denise Lopes
Beneficiário:Maria Denise Lopes
Instituição-sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Pesq. associados:Andressa Dalmazzo
Assunto(s):Hormônio antimülleriano  Técnicas in vitro  Fisiologia da reprodução  Criopreservação  Ovário  Lobos  Cães 

Resumo

O objetivo é caracterizar as concentrações de hormônio anti-mülleriano (AMH) em lobas cinza (Canis lupus baileyi) (experimento 1) e em cadelas domésticas (experimento 2) e utilizar os níveis séricos de AMH de cadelas como ferramenta de escolha das doadoras de ovário a serem criopreservados, como modelo experimental para lobas, bem como avaliar a produção de AMH in vitro em amostras de córtex ovariano de cadelas, a fresco e após a descongelação (experimento 3). Experimento 1: Determinação dos níveis hormonais séricos de hormônio anti-muleriano em lobas cinza. Serão utilizadas 7 fêmeas de lobo cinza comum. As lobas terão seu sangue uma durante a sua estação reprodutiva (inverno) e outra durante o anestro (verão) durante dois anos consecutivos. Será realizado um questionário para registro do histórico reprodutivo com intuito de correlacionar estas informações com as concentrações de AMH. Experimento 2: Determinação dos níveis hormonais séricos de hormônio anti-muleriano em cadelas. Serão coletadas amostras de sangue de 90 cadelas divididas em 6 grupos experimentais: pré-púberes (G1, n=15), cadelas jovens (1º e 2º cio) (G2, n=15), adultas (G3, n=15), gestantes (G4, n=15), idosas (acima de 8 anos) (G5, n=15) e castradas (G6, n=15). Para os grupos G3 e G4, serão realizadas coletas de sangue em cada uma das fases do ciclo estral (proestro, estro, diestro e anestro) com o objetivo de avaliar possíveis flutuações das concentrações de AMH durante o ciclo. Todas as amostras serão centrifugadas e o soro armazenado a -20ºC até a realização das análises. Dosagens de AMH sérico serão realizadas através de ELISA (AnshLab, Texas, EUA). Experimento 3: Produção de AMH em cultura in vitro de ovários frescos e após descongelação de cadelas. Vinte cadelas serão castradas e uma amostra de sangue será coletada, centrifugada e armazenada a -80 oC, os ovários serão isolados e terão seu córtex fatiado, um fragmento será destinado ao cultivo in vitro, outro será processado para análise histológica e outros dois fragmentos serão vitrificados para posterior cultivo in vitro e análise histológica. Para o aquecimento, as amostras serão imersas imediatamente em uma placa Petri contendo solução de descongelação e depois imersas em solução de sucrose a 0,5M (SS). Para cultivo in vitro as amostras frescas e descongeladas serão fatiadas em pedaços menores e serão transferidas para placas de 96 poços contendo 200 µL de solução de crescimento folicular (GM). As placas serão mantidas a 5% CO2 a 38,5°C, a cada dois dias 100 µL de meio serão removidos e armazenados em criotubos a -20ºC para dosagens de AMH. O mesmo volume de meio fresco será adicionado aos poços. Após 7 dias de cultura in vitro, as amostras serão removidas e processadas para análise histológica. As dosagens de estrógeno e progesterona das amostras provenientes do cultivo in vitro serão realizadas utilizando kits comerciais para técnica de radioimunoensaio, e as dosagens de AMH do meio e das amostras de soro serão realizadas através de ELISA (AnshLab, Texas, EUA) no laboratório de endocrinologia do Zoológico de Saint Louis. (AU)