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Análise da via de sinalização MAP cinase em linfócitos TCD4+ ativados em curtos períodos de exposição ao vírus da imunodeficiência adquirida tipo 1 HIV-1

Processo: 16/22876-3
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de agosto de 2017 - 31 de julho de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biologia Geral
Pesquisador responsável:Luiz Mário Ramos Janini
Beneficiário:Luiz Mário Ramos Janini
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Latência viral  Replicação viral  Linfócitos T CD4-positivos  Proteínas quinases S6 ribossômicas  Inativação gênica  HIV-1 

Resumo

Introdução: No Brasil, em dados divulgados pela ONU (Organização das Nações Unidas) recentemente, destacam que existem 734 mil pessoas infectadas com HIV, sendo que somente em 2014 houve um número de 44,000 novas infecções. Mesmo com todo o apoio do poder público o número de pessoas infectadas vem aumentando, principalmente na população mais jovem. Um dos fatores que impede a erradicação do HIV-1 nos pacientes infectados é a latência viral. Muitos fatores estão envolvidos no estabelecimento e manutenção da latência do HIV, incluindo a organização da cromatina nas regiões de integração viral por modificações epigenéticas. Resultados preliminares obtidos na tese de mestrado concluída no laboratório de retrovirologia, revelaram um aumento da expressão gênica e proteica de RSK2 em células TCD4+ infectadas com HIV,esta proteína esta relacionada á mecanismos epigenéticos que levam á ativação transcricional do gene do HIV, em contrapartida neste mesmo estudo foi observado uma diminuição da fosforilação da serina 227 da proteína de RSK2,esta fosforilação é importante para a ativação da função cinase de RSK2, com a diminuição desta fosforilação a sua atividade de cinase foi diminuída e consequentemente houve uma diminuição na fosforilação de fatores transcricionais que estão relacionados á RSK2, como o fator CREB e a H3S10, levando á uma diminuição da atividade transcricional gênica global. Dessa forma, vemos que a função de RSK2 esta sendo modulada de forma negativa, mas esta modulação esta relacionada diretamente á via em que RSK2 esta inserida, a via Map-cinase, ou seja, estudar esta via em maiores detalhes se faz necessário para um entendimento dos mecanismos de ativação de RSK2 que podem estar relacionados á uma serie de fatores importantes também para a transcrição do gene do HIV. Alem disso, como RSK2 esta envolvida em uma via de ativação intracelular a analise desta via e da proteína RSK2 podem ser importantes para o descobrimento de fatores que podem ser de grande relevância no processo de replicação e latência viral e podem servir como mecanismos para obtenção de estratégias terapêuticas na contenção da infecção viral e no entendimento dos mecanismos de estabelecimento da latência. Objetivo: O objetivo geral do presente trabalho é interferir na via map cinase,via em que RSK2 está inserida mediante seu o silenciamento, relacionando tal interferência com a produção viral. Materiais e métodos: A partir de um concentrado de hemácias e leucócitos, serão separadas células mononucleares do sangue periférico por gradiente de densidade utilizando o reagente Ficoll Paque, os linfócitos TCD4 serão purificados a partir de PBMCs e ativados para posterior transfecção. A transfecção será realizada utilizando oligos de silenciamento de RSK2. Depois de transfectadas as culturas serão infectadas com HIV-1 T-trópico. As infecções serão interrompidas nos tempos de 6h, 12h, 24h e 36h para obtenção de amostras de DNA, RNA e proteína. As amostras de DNA serão utilizadas para análise de DNA proviral e como controle das infecções pela metodologia de PCR quantitativa, os RNAs extraídos serão utilizados para análise de expressão gênica RSK2 pela metodologia de PCR quantitativa, as proteínas obtidas serão separados em extratos nuclear e citoplasmático e utilizados para a análise de expressão e modificação proteica por Western Blot. A análise de produção viral será pela metodologia de Elisa P24 que analisa a produção da proteína do envelope viral e a produção de RNAm viral pelo sistema de análise automatizado mAbbot. (AU)