Produção transiente in vitro e in vivo de Fator IX de coagulação sanguínea humana (hFIX) para a caracterização, avaliação da atividade e screening funcional da via mamária com vistas à produção de hFIX no leite do bovinos transgênicos

• Processo: 16/16468-0
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE
• Vigência: 01 de agosto de 2017 - 30 de abril de 2018
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Pesquisador responsável: Marc Peter Maserati Jr
• Beneficiário: Marc Peter Maserati Jr
• Empresa Sede: In Vitro Brasil Clonagem Animal S/A
• Município: Mogi Mirim
• Pesquisadores associados: Luciana Relly
• Assunto(s): Biotecnologia Animais geneticamente modificados Clonagem Biofármacos Fator IX
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biofármaco | clonagem | Fator IX | transgênico | Transgenia Animal

Resumo

Este projeto de visa integrar ferramentas biotecnológicas avançadas para estabelecer um sistema eficiente de produção do fator de coagulação sanguíneo IX recombinante humano (rhFIX) para o tratamento da Hemofilia B, doença causada pela deficiência desta proteína funcional na cascata de coagulação sanguínea. A síntese do hFIX é hepática e na forma inativa de serino-protease, onde sofre diversas modificações pós-traducionais (MPT) antes da secreção ao plasma. O FIX ativado (FIXa) ativa o Fator X da coagulação, há a formação de trombina a partir da pró-trombina e a formação de fibrina do fibrinogênio, que, ao se polimerizar, consolida o tampão plaquetário ou coágulo. A mutação no hFIX leva à falha na coagulação e à Hemofilia B. O tratamento da Hemofilia B tem como base a reposição do hFIX pela infusão intravenosa do concentrado de hFIX. No Brasil, o tratamento é realizado totalmente com FIX derivado do plasma humano, processado no exterior que volta liofilizado com altos custos ao SUS (R$ 52 milhões/ano), além da chance de veicular doenças. Estes sistemas de produção de rhFIX podem ser substituídos por métodos mais produtivos, como a plataforma animal de produção de proteínas na glândula mamária, principal objetivo em longo prazo desta proposta. O leite de animais transgênicos é considerado uma das melhores fontes de obtenção de proteínas recombinantes para uso biomédico, sendo altamente competitiva, com baixo custo de implementação e elevada produtividade. A execução deste projeto visa o uso da capacidade secretória do leite para a produção eficaz de proteínas complexas como o rhFIX, que é centrado na capacidade da glândula mamária de realizar modificações co- e pós-traducionais de forma comprovadamente mais eficiente do que em células em cultivo. Em termos gerais, visamos a produção do Fator IX humano recombinante (rhFIX) na sua forma ativa em grande escala e de forma eficaz no leite de bovinos por meio de dois excelentes sistemas biológicos para o screening e produção do rhFIX em larga escala na plataforma animal, buscando ultimamente alternativas que garantam a produção de proteínas funcionais no modelo transgênico animal. Em virtude da eficiência e rapidez em se obter proteínas recombinantes, um dos sistemas para a obtenção e screening do rhFIX, é a expressão transiente da proteína de interesse (rhFIX) utilizando-se vetores adenovirais recombinantes (rAAV). Propõe-se a expressão transiente de proteínas recombinantes in vitro, em células da glândula mamária em cultivo, e in vivo, na glândula mamária de fêmeas caprinas e leporinas lactantes, por metodologia já bem estabelecida por nossos colaboradores no Brasil. Serão produzidas as partículas de adenovírus recombinantes in vitro, que serão injetadas na glândula mamária de fêmeas bovinas e leporinas. Dessa forma, o rFIX e a rFurina serão produzidos de maneira transiente no leite, permitindo testar a construção bicistrônica e caracterizar o rhFIX produzido nos distintos sistemas. Uma vez purificadas do meio de cultivo ou do leite, o rhFIX recombinantes será avaliado quanto à estrutura e atividade, para então estabelecer linhagens transgênicas de células somáticas de bovinos, para no futuro (Fase II) serem utilizadas para o desenvolvimento de bovinos transgênicos pela clonagem animal. A construção gênica bicistrônica dos genes de hFIX e hFurina será inserida em vetor que contém promotor que direciona a expressão exclusiva para a glândula mamária. Para o estabelecimento eficiente deste modelo de animal transgênico, outras tecnologias suporte serão utilizadas em combinação aos dois sistemas de expressão, como o uso de safe harbour loci, e o sistema de edição do DNA por CRISPR/Cas9. Desta forma, o transgene será utilizado na co-transfecção de fibroblastos fetais bovinos com sistema CRISPR/Cas9 para o locus ROSA26 do genoma bovino, com posterior seleção e diagnóstico molecular das células transgênicas, com vistas à utilização futura na clonagem por TNCS. (AU)