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Caracterização estrutural e funcional de uma alfa-L-arabinofuranosidase (GH62) altamente secretada por Aspergillus nidulans cultivado em bagaço de cana-de-açúcar

Processo: 17/19064-0
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
Vigência: 01 de novembro de 2017 - 30 de abril de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
Pesquisador responsável:André Ricardo de Lima Damasio
Beneficiário:André Ricardo de Lima Damasio
Instituição-sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:12/20549-4 - Secreção de glicoproteínas heterólogas em Aspergillus: efeito do padrão de glicosilação em parâmetros funcionais de glicosil hidrolases, AP.BIOEN.JP
Assunto(s):Aspergillus nidulans  Engenharia de proteínas 

Resumo

Enzimas ativas em carboidratos são enzimas chave para a conversão de biomassa vegetal em bioprodutos. ±-L-Arabinofuranosidases classificadas na família glicosil hidrolase 62 (GH62) apresentam importantes aplicações na produção de biocombustíveis a partir de biomassa vegetal, através da hidrólise de arabinoxilanos, encontrados na parede celular primária e secundária das plantas. Neste trabalho, nósidentificamos uma ±-L-arabinofuranosidase GH62 (AnAbf62Awt) que foi altamente secretada quandoAspergillus nidulans foi cultivado em bagaço de cana-de-açúcar. O gene AN7908 foi clonado etransformado em A. nidulans para produção homóloga de AnAbf62Awt, e confirmamos por espectrometria de massas que a enzima é N-glicosilada na asparagina 83. A enzimatambém foi expressa em Escherichia coli e os estudos de dicroísmo circular mostraram que atemperatura de melting e o perfil estrutural de AnAbf62Awt e a enzima não glicosilada (AnAbf62Adeglyc) foram altamente similares. Além disso, o glicomutante AnAbf62AN83Q apresentou padrões semelhantes de secreção e atividade comparado a AnAbf62Awt, indicando que o N-glicano não influencia nas propriedades desta enzima. A estrutura cristalográfica de AnAbf62Adeglyc foi obtida e o modelo de resolução a 1.7 Â mostrou um padrão five-bladed ²-propeller, que é conservado na família GH62. Os mutantes AnAbf62AY312F e AnAbf62AY312S mostraram que Y312 representa um resíduo importante para ligação ao substrato. As simulações de dinâmica molecular indicaram que o loop contendo Y312 poderiaacessar diferentes conformações separadas por barreiras de energia moderadamente baixas. Uma dessas conformações, que compreendem um mínimo local, é responsável por aproximar Y312 da ligação glicosídica de arabinose e, portanto, pode ser importante para a eficiência catalítica. (AU)

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