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Interação Crotoxina e Macrófagos: Estudo da Participação de Receptor Peptídeo Formil e de Domínios Lipídicos nos Mecanismos Envolvidos no Processo de Reconhecimento Molecular Toxina-Membrana

Resumo

Diversos estudos mostraram que a Crotoxina (CTX), formada pela associação das subunidades CA e CB, toxina majoritária do veneno de Crotalus durissus terrificus, apresenta, in vivo e in vitro, ações antitumoral, anti-inflamatória, antiviral e imunomoduladora. No que concerne às atividades imunomoduladoras, a CTX estimula, em particular, o metabolismo energético de macrófagos e a produção de citocinas, lipoxina A4 e análogo 15-Epi-LXA4, por essas células, levando à inibição dos eventos envolvidos com a progressão tumoral e angiogênese. Essas ações da CTX são bloqueadas, na sua totalidade, pelo Boc-2, um antagonista seletivo de receptores para peptídeo formil (PFRs). Esse dado evidencia a importância desses receptores para as atividades imunomoduladoras da CTX. Entretanto, apesar dessas evidências, não se sabe até o momento de que maneira a CTX induz suas ações em macrófagos, bem como de que maneira esses receptores estão envolvidos. Portanto, caracterizar o processo de reconhecimento molecular da CTX em macrófagos é crucial para compreender como esta toxina é capaz de acarretar as diferentes atividades sobre o metabolismo e a função dessas células. Assim, o objetivo do presente projeto é avaliar a interação do complexo CTX com estruturas da membrana celular de macrófagos, tais como FPRs e os domínios lipídicos envolvidos com estrutura da membrana e com formação de poros, fundamentais para a transdução da sinalização e funções das células. Para tanto, serão realizados: 1) Ensaios das atividades biológicas, em modelos de cultura bi e tridimensionais, visando demonstrar a participação dos FPRs, no efeito da CTX sobre as atividades funcionais dos macrófagos. Nesta fase, será avaliada a expressão dos FPRs na célula THP-1, uma célula de linhagem monocítica, por meio de silenciamento. O silenciamento será realizado por meio da técnica de eletroporação com a tecnologia de nucleofecção. As THP-1, silenciadas ou não, serão incubadas com a CTX marcada com sonda fluorescente e avaliadas em ensaio de Time Lapse. Após o silenciamento os ensaios funcionais, tais como fagocitose e liberação e produção de H2O2 e NO, respectivamente, serão determinados; 2) Em ensaios da fase sintética, para avaliar interação CTX-membrana, serão utilizados lipossomas ou vesículas sintéticas, formadas a partir de lipídios sintéticos, neutros ou carregados, os quais são mais abundantes na membrana celular dos macrófagos, serão utilizadas em ensaios de interações CTX-membrana. Esses ensaios permitirão avaliar, por meio da Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) e a Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), quais os tipos de interações com a membrana a CTX é capaz de realizar. Considerando a importante atividade da CB (Fosfolipase A2 - FLA2) sobre os fosfolipídios de membrana serão utilizadas também as subunidade CA e CB, dissociadas, com a finalidade de comparar com as atividades do complexo CTX. É importante ressaltar que estas técnicas da física são bem estabelecidas e aplicadas frequentemente na química, bioquímica, biologia celular, biotecnologia, farmacologia, e recentemente na nanociência. (AU)

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