Bioquímica estrutural das enzimas envolvidas na biossíntese de c-di-AMP em staphyl...
- Auxílios pontuais (curta duração)
| Processo: | 17/18173-0 |
| Linha de fomento: | Auxílio à Pesquisa - Regular |
| Vigência: | 01 de fevereiro de 2018 - 31 de janeiro de 2020 |
| Área do conhecimento: | Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular |
| Pesquisador responsável: | Alessandro Silva Nascimento |
| Beneficiário: | Alessandro Silva Nascimento |
| Instituição-sede: | Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil |
| Assunto(s): | Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Cristalografia de proteínas Glicosiltransferases |
Resumo
O surgimento de cepas bacterianas resistentes a antibióticos representa um risco importante para a saúde humana. Doenças infecciosas representam a terceira causa de morte em todo o mundo, de acordo com a Organização Mundial de Saúde, e dados de vigilância retirados de hospitais nos EUA indicam que cerca de 50% das cepas avaliadas de Staphylococcus aureus encontrados em infecções na corrente sanguínea são resistentes a antibióticos b-lactâmicos. O mesmo relatório demonstrou que cerca de 80% das cepas de Enterococcus faecalis encontrados em infecções de locais cirúrgicos eram resistentes à vancomicina. Esses dados destacam a urgência de uma compreensão mais profunda dos mecanismos utilizados pelas bactérias para a aquisição de resistência aos antibióticos e de uma identificação de novos alvos moleculares para o planejamento de novos candidatos a antibióticos. Nesta proposta, objetivamos investigar a relação estrutura-função de três enzimas anteriormente demonstradas como envolvidas na aquisição de resistência a antibióticos. A primeira enzima é uma UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase (MnaA) de S. aureus, envolvida na interconversão de UDP-N-acetilglicosamina (UDP-GlcNAC) e UDP-N-acetilmanosamina (UDP-ManAc). Estes sacarídeos são utilizados na síntese da parede de ácidos teicóicos (WTA), e quando a enzima é inativada ou suprimida, a concentração inibitória mínima (MIC) para vários antibióticos ²-lactâmicos é reduzida, indicando a sensibilização da cepa. As outras duas enzimas são glicosiltransferases (GTs) de E. faecalis e foram recentemente demonstradas como envolvidas na decoração da matriz do biofilme. A perda de função desses genes, denominados epaI e epaOX, resultou em uma diminuição da formação do biofilme e maior susceptibilidade aos antibióticos. Aqui, propomos uma investigação da dinâmica da abertura/fechamento de MnaA durante a catálise, a fim de identificar o estado estrutural mais provável para a interação com um inibidor. Este objetivo envolve uma avaliação precisa da variação na energia livre associada à abertura da enzima utilizando a abordagem de metadinâmica em simulações de dinâmica molecular. O estado mais provável será utilizado para a triagem de candidatos através do docking de ligantes. Os compostos identificados nesta fase serão adquiridos e testados experimentalmente para caracterizar a ligação e sua capacidade de inibir a atividade enzimática. Os genes para as GTs de E. faecalis serão clonados e utilizados para a expressão heteróloga em E. coli. As enzimas purificadas serão utilizadas em ensaios de cristalização para a determinação da estrutura cristalográfica. As estruturas, uma vez obtidas, serão também utilizadas para a triagem de candidatos inibidores usando o docking de ligantes. (AU)