Resumo
Bactérias possuem complexos multiproteicos grandes (multi-mega Dalton) que transportam proteínas efetoras através de membranas bacterianas para o meio extracelular ou diretamente dentro de outras células. Esses sistemas também medeiam a transferência horizontal de material genético (conjugação) entre células bacterianas e formas homólogas especializadas desses sistemas evoluíram para pili e flagelos bacterianos. Portanto, os sistemas de secreção macromolecular são determinantes importantes para a adaptação bacteriana, competição e sobrevivência em diversos nichos ambientais. No decurso do projeto temático anterior, demonstramos a importância do pili tipo IV (T4P) na motilidade twitching e na formação de biofilmes em Xanthomonas citri e caracterizamos os principais reguladores da biogênese do T4P. Também mostramos que o sistema de secreção de Xanthomonas citri tipo IV (T4SS) fornece a essas células a capacidade de matar outras espécies bacterianas Gram-negativas de maneira dependente do contato. Esta foi a primeira demonstração do envolvimento de um T4SS em matança bacteriana e aponta para esta classe especial de T4SS como um determinante importante para a sobrevivência de Xanthomonas durante encontros competitivos com outras espécies bacterianas no meio ambiente. Neste projeto, propomos seguir várias linhas de pesquisa sobre a estrutura molecular, função molecular e relevância fisiológica dessas nano-máquinas complexas em Xanthomonas citri, bem como em outros membros da família Xanthomonadaceae. Especificamente, seguiremos duas linhas gerais de investigação. Projeto 1: estudos sobre os sistemas de secreção do tipo IV de Xanthomonadaceae. Nós planejamos i) determinar a estrutura dos componentes individuais do T4SS de X. citri, bem como os sub-complexos principais e o complexo inteiro; ii) realizar estudos estruturais e enzimológicos sobre as toxinas segregadas por este sistema, bem como seus inibidores cognatos; iii) estudar a base molecular do reconhecimento de toxinas pelo aparelho do T4SS; iv) estudar a localização celular e a regulação da expressão do T4SS, e v) ampliam nossos estudos do sistema X. citri aos T4SS homólogos encontrados em outras espécies bacterianas, incluindo Stenotrophomonas, Lysobacter e em algumas espécies das ordens de Betaproteobactérias Burkholderiales e Neisseriales. Projeto 2: estudos sobre o pilus tipo IV (T4P) em Xanthomonas citri. Planejamos investigar i) como a atividade ATPase de PilB é regulada pelos componentes PilZ, FimX e c-diGMP e outros componentes da membrana interna (plataforma); ii) as estruturas dos complexos PilB-PilZ e PilB-PilZ-FimX; iii) os papéis das pilinas menores conservadas nas espécies Xanthomonadaceae; iv) o papel da PilU, a terceira e mal compreendida ATPase; v) como os sinais ambientais específicos controlam as funções dependentes de T4P nas espécies Xanthomonas; vi) como o T4P contribui para a competitividade de Xanthomonas em interações antagônicas com outras espécies bacterianas, e vii) a estrutura do pilus extracelular (polímero das subunidades PilA). Nestes estudos empregaremos métodos de Biologia Estrutural (cristalografia, ressonância magnética nuclear, criomicroscopia eletrônica, SAXS, simulações moleculares) a produção e caracterização de nocautes gênicos, microscopia de fluorescência, enzimologia, estudos de expressão gênica e bioinformática. O projeto inclui o treinamento de estudantes de graduação, pós-graduação, pós-doutores e colaborações com pesquisadores de outras instituições brasileiros e estrangeiros. (AU)
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