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Análise de interações proteína-proteína de Xanthomonas axonopodis pv citri utilizando tecnologia his6-tag

Processo: 05/01225-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2005
Vigência (Término): 31 de julho de 2007
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Marcos Antonio Machado
Beneficiário:Flavia Vischi Winck
Instituição-sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Assunto(s):Citrus   Espectrometria de massas   Proteínas   Proteômica   Xanthomonas

Resumo

A bactéria Gram negativa Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é o agente causador do cancro cítrico, doença que afeta grande parte dos pomares brasileiros gerando perdas econômicas significativas na produção de citrus. O completo sequenciamento do genoma de Xac revelou um grande número de potenciais alvos moleculares que podem estar intimamente relacionados aos mecanismos moleculares da patogênese e patogenicidade, entretanto é necessário prosseguimento de estudos sobre estes alvos na busca pela melhor interpretação e compreensão dos mecanismos funcionais em que estão inseridos. A patogênese do cancro cítrico aparentemente não pode ser atribuída à atuação isolada de uma proteína, e deve possivelmente decorrer por múltiplos fatores. A seleção de proteínas alvo e o estudo da interação entre estas proteínas com outras proteínas endógenas de Xac mostra-se uma forma interessante de reconhecermos mecanismos moleculares relacionados a patogenicidade, reconhecendo-se novas interações proteína-proteína e ampliando as possibilidades para traçarmos possíveis redes de organização funcional celular de Xac.Para a análise de possíveis interações entre alvos moleculares de Xac e proteínas associadas, propõe-se utilizar a tecnologia de His6 tag (polyhistidine tag). Nesta técnica faz-se o isolamento de um gene de interesse, a expressão da proteína alvo fusionada à uma cauda de polihistidina e sua adsorção em uma coluna de afinidade. O extrato celular de células de Xac mutantes para o gene alvo pode então ser submetido à coluna de afinidade onde está adsorvida a proteína alvo. As proteínas do extrato celular de Xac mutante que tiverem afinidade pela proteína alvo ficarão ligadas a ela. Após a eluição dos componentes não associados, as proteínas formadoras do "complexo" (proteína alvo + proteínas associadas) serão eluídas e identificadas por espectrometria de massas. Com esta tecnologia podemos analisar complexos protéicos e interações do alvo molecular (proteína de interesse) com proteínas associadas, fato este que favorece a identificação de interações ainda não descritas. Os genes alvos a serem analisados são hrpF (XAC0394 [gi:21106473]) e avrXacE2 (XAC3224 [gi:21109561]) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).Foi demonstrado que mutantes para o gene hrpF apresentaram um fenótipo típico de hrp com redução significativa na virulência e das reações de hipersensibilidade (HR) na patogênese, exceto em plantas de pimenta15. Acredita-se que HrpF funcione como translocador de proteínas efetoras e não afete a secreção de outras proteínas efetoras, podendo ter outras funções que são cruciais para a plena patogenicidade e habilidade do patógeno em induzir HR em plantas não hospedeiras15,28.O gene avrXacE2 pertence a um conjunto de genes conhecidos como genes de avirulência (avr) que são proteínas efetoras e acredita-se estão envolvidos na virulência através da sinalização de passos metabólicos específicos nas células da planta hospedeira, favorecendo a invasão bacteriana. O termo "avirulência" define, portanto, genes que determinam o reconhecimento específico da bactéria pela planta possuidora de um gene de resistência (R). O sistema de secreção tipo III (TTSS) media a translocação de proteínas efetoras através da membrana bacteriana para o interior do hospedeiro e é importante para a virulência e modulação da resposta de defesa do hospedeiro15,28,29. A seqüência de aminoácidos da região N-terminal das proteínas secretadas via TTSS pode ser determinante para a secreção, e acredita-se que existam outros mecanismos que favoreçam a secreção destas proteínas, como a ligação de chaperonas a domínios específicos da proteína, favorecendo a solubilização e estabilização das proteínas a serem secretadas via TTSS. As informações acima descritas tornam as proteínas HrpF e AvrXacE2 potenciais alvos para entendermos melhor a patogenicidade de Xac, ampliando as perspectivas para criação de novas formas de combate ao cancro cítrico.

Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
WINCK, Flavia Vischi. Estudo das proteinas HrpF e AvrXacE2 na patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri. 2007. Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia.

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