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Clonagem, expressão e estudo da especificidade por substrato da peptidase intermediária mitocondrial

Processo: 07/00710-7
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de agosto de 2007
Vigência (Término): 31 de março de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
Pesquisador responsável:Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandão de Oliveira
Beneficiário:Marcelo Ferreira Marcondes Machado
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Peptídeo hidrolases

Resumo

O presente projeto de pesquisa tem como objetivo principal o estudo da especificidade por substrato de uma peptidase denominada peptidase intermediária mitocondrial (EC 3.4.24.59, MIP), comparativamente com duas homólogas visando à obtenção de substratos e inibidores específicos. Os poucos estudos sobre a MIP indicam que essa peptidase participa do processamento de proteínas importadas pela mitocôndria clivando e consequentemente retirando a sequencia de sinalização mitocondrial N-terminal dessas proteínas na matriz mitocondrial. A MIP é homóloga a timet oligopeptidase e a neurolisina, peptidases bem caracterizadas que têm sido estudadas em detalhes inclusive em nosso Laboratório. Apesar de existirem alguns trabalhos concluindo que a MIP participa desse processamento das proteínas importadas pelas mitocôndrias, não existem evidências que a MIP atua diretamente sobre as proteínas, apenas evidências indiretas obtidas com estudos em Saccharomyces cerevisiae com o gene da MIP inativado. Além disso, diferentemente da MIP, suas homólogas não são capazes de hidrolisar proteínas, atuando somente em oligopeptídeos com menos de 17 resíduos devido à localização dos seus centros ativos em um canal profundo existente na estrutura dessas peptidases. Estudar o mecanismo de seleção dos substratos pela MIP em comparação com suas homólogas deve ajudar a confirmar ou não essa possível diferença da MIP. Para isso pretendemos clonar e expressar a MIP humana em um sistema heterólogo e realizar ensaios de cinética enzimática com uma série de substratos já ensaiados com a TOP e neurolisina, com uma série de inibidores e ainda com substratos de cadeias polipeptídicas de tamanhos crescentes e baseados nas possíveis sequencias de reconhecimento da MIP descritos. Caso fique confirmado que, diferentemente de suas homólogas TOP e neurolisina, a MIP seja capaz de hidrolisar substratos com cadeias polipeptídicas relativamente grandes, como no caso das proteínas importadas pela mitocôndria, uma questão relevante que surge é qual característica estrutural que leva a essa diferença. Como a MIP não tem sua estrutura cristalográfica conhecida até o momento, a clonagem e a expressão da MIP em um sistema heterólogo que é um dos objetivos do projeto permitirá a produção de MIP recombinante em escala e homogeneidade suficiente para estudos de cristalização dessa proteína com a finalidade de se determinar a sua estrutura tridimensional. (AU)