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Avaliação da glicolisação não enzimática (glicação) sobre a inflamação aguda induzida por fosfolipases A2 secretorioas pró-inflamatórias isoladas de venenos de serpentes crotálicas e botrópicas

Processo: 07/55509-4
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2008
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Hikari Toyama
Beneficiário:Simone Cristina Buzzo
Instituição-sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Assunto(s):Diabetes mellitus   Cinética enzimática   Inflamação   Edema

Resumo

O objetivo deste projeto será avaliar o efeito de glicosilações não enzimáticas (Glicação) sobre a inflamação aguda induzida por PLA2 secretórias pró-inflamatórias isoladas do veneno de serpentes botrópicas e crotálicas. Além disso, pretendemos investigar os efeitos da glicação sobre a estrutura e função de fosfolipases A2, previamente tratadas com alguns tipos de carboidratos simples. Fosfolipases A2 secretórias isoladas de veneno serão previamente tratadas com concentrações predeterminadas dos diferentes carboidratos e as condições para as glicações serão realizadas variando-se o tempo, temperatura, pH e o tipo de tampão envolvido. Vamos avaliar o efeito dos diferentes carboidratos sobre a atividade catalítica das PLA2s cataliticamente ativas, monitorando mudanças nos parâmetros cinéticos de Vmax e Km das PLA2s nativas e tratadas. Além disso, pretendemos utilizar técnicas de eletroforese em PAGE-SDS, Tricina PAGE-SDS, isoeletrofocalização, coloração com técnicas especiais para carboidratos, de espectrometria de massa em MALDI-TOF e análise de aminoácidos para detecção de possíveis glicosilações das proteínas de; PLA2s tratadas com carboidratos. Finalmente, para caracterização em nível estrutural destas modificações pretenderemos usar técnicas cristalográficas para determinar e localizar as regiões de interação dos diferentes carboidratos com as PLA2s e possibilitará o fornecimento de subsídios para esclarecer a real importância destas glicosilações na enzima. O efeito destas glicosilações não enzimáticas nas PLA2s secretórias pró-inflamatórias será avaliado através de alguns ensaios farmacológicos, como: o efeito neurotóxico, efeito sobre a atividade miotóxica, secreção de insulina estática utilizando células beta isoladas de camundongo como modelo experimental para caracterizar o efeito da glicação de PLA2 sobre a secreção de insulina, atividade de agregação plaquetária induzida e por fim, iremos caracterizar o efeito do tratamento das PLA2s secretórias com os diferentes carboidratos sobre a inflamação aguda induzida pelas PLA2s nativas. Para isso faremos edema de pata e de pele e atividade degranulante de mastócitos isolados. (AU)