Trafego intracelular de vetores nao-virais: desenvolvimento de proteinas de fusao para o transporte de dna plamidial atraves da interacao com proteinas motoras

• Processo: 08/55909-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Vigência (Início): 01 de março de 2009
• Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2011
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Adriano Rodrigues Azzoni
• Beneficiário: Marcelo Augusto Szymanski de Toledo
• Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 07/58323-9 - Estudo e desenvolvimento de proteínas de fusão para o transporte intracelular de vetores não virais através de proteínas motoras, AP.JP
• Assunto(s): Proteínas recombinantes Terapia genética
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Motores Moleculares | Proteinas Recombinantes | Terapia Genica | Trafego Intracelular Por Pdna | Vacinacao Por Dna | Vetores Nao Virais

Resumo

Apesar de seguros e simples de produzir, o uso de vetores não virais como o DNA plasmodial (pDNA) em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA tem sido limitado pela baixa eficiência quando comparados aos vetores virais. Essa limitação provém principalmente da limitada capacidade de superar as barreiras físicas, enzimáticas e difusionais encontradas durante o tráfego para o interior do núcleo das células alvo. O principal objetivo do projeto aqui proposto é o estudo e desenvolvimento de proteínas recombinantes de fusão capazes de interagir e facilitar o transporte intracelular de pDNA explorando-se a capacidade natural da proteína motora Dineína para o transporte de cargas da periferia para o interior (centrossoma) de células de mamífero. Proteínas de fusão contendo domínios ou seqüências N-terminais de ligação ao DNA (16 resíduos de aminoácidos básicos) e domínios C-terminais de ligação à Dineínas serão primeiramente clonadas e produzidas em E. coli. As interações proteínas de fusão-pDNA serão então avaliadas em ensaios in vitro e por transfecções de células de mamífero em cultura, através da quantificação da expressão do gene repórter GFP por microscopia de fluorescência. O tráfego intracelular dos complexos será estudado por microscopia, avaliando-se a capacidade das proteínas de fusão de facilitar o tráfego intracelular do pDNA através de interações com Dineínas, além dos papéis desempenhados pelos microtúbulos. Espera-se dessa forma levantar informações importantes sobre alguns dos principais mecanismos envolvidos em etapas cruciais do tráfego intracelular, especialmente no que diz respeito ao papel dos microtúbulos e o desenvolvimento de uma forma eficiente de recrutar motores moleculares para entrega gênica. Um outro resultado esperado deste estudo é o desenvolvimento de carreadores protéicos capazes de reduzir a diferença de eficiência presente atualmente entre vetores não-virais e virais utilizados em estudos de vacinação com DNA e terapia gênica. (AU)