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Estudo da função do gene PA14_41070 de Pseudomonas aeruginosa, envolvido em patogenicidade e "quorum sensing"

Processo: 07/03121-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2008
Vigência (Término): 31 de janeiro de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Regina Lúcia Baldini
Beneficiário:Diogo de Abreu Meireles
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:03/09253-7 - Regulação de genes de patogenicidade: uso da bactéria Pseudomonas aeruginosa pa14 como um modelo de estudo de genes envolvidos na patogenicidade, AP.JP
Assunto(s):Pseudomonas aeruginosa   Percepção de Quorum   Virulência

Resumo

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria extremamente versátil, com capacidade de colonizar diversos tipos de ambiente e infectar uma ampla variedade de hospedeiros, incluindo plantas, insetos e humanos. P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários genes envolvidos em patogenicidade contra hospedeiros filogeneticamente distintos. Um destes genes, anotado como PA14_41070, foi detectado em uma biblioteca de mutantes por inserção de transposon numa triagem por mutantes atenuados em virulência. A linhagem mutante D12 foi construída pela deleção de PA14_41070 em PA14 e a resposta de Drosophila melanogaster infectada com essas linhagens foi comparada. Enquanto a expressão de peptídeos antimicrobianos é inibida na infecção por PA14, moscas infectadas com D12 apresentam indução dos genes correspondentes (Apidianakis et al., PNAS 102:2573-8, 2005). D12 também apresenta diferenças em fenótipos cuja expressão é regulada via quorum sensing. A menor produção de ramnolipídeo e maior produção de piocianina em D12, por exemplo, deve-se a diferenças na expressão dos genes envolvidos na síntese desses compostos. O gene PA14_41070 não apresenta similaridade com genes de função conhecida, porém seu produto apresenta domínios de metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina. Não foram encontrados outros domínios de ligação de DNA, RNA, proteínas, ou outras moléculas pequenas. PA14_41070 encontra-se à montante dos genes rnhA e dnaQ, numa organização que sugere a presença de um operon. O produto de rnhA, a RNase HI, é uma ribonuclease que degrada RNA que faz parte de fitas híbridas DNA-RNA, como nos iniciadores de fragmentos de Okazaki. DnaQ é a subunidade da DNA polimerase III responsável por correção de erros, com atividade exonucleásica 3linha-5linha. A proximidade e a aparente co-transcrição do gene PA14_41070 com genes envolvidos na replicação/reparo de DNA podem sugerir que a função de seu produto esteja de alguma maneira ligada a estes mecanismos. Em E. coli, o estado de metilação do DNA, determinado pela metiltransferase Dam, é importante por exemplo no reparo tipo mismatch repair, que acontece no sentido de restaurar o pareamento das fitas do DNA pós-replicação, utilizando como molde a fita-mãe, metilada, e corrigindo os erros introduzidos na fita-filha, que permanece desmetilada momentaneamente. Em P. aeruginosa, não existem relatos na literatura sobre o estado de metilação do DNA e não há genes homólogos a dam ou a outros genes de DNA-metiltransferases anotados em seu genoma. Uma hipótese atraente seria de que a metiltransferase codificada por PA14_41070 teria como alvo o DNA, agindo provavelmente em conjunto com outras proteínas, que poderiam conferir afinidade e especificidade a sua atividade. O objetivo deste trabalho, portanto, é estudar a função da proteína codificada pelo gene PA14_41070 de P. aeruginosa PA14. Num primeiro momento, o envolvimento de PA14_41070 com reparo de DNA será analisado comparando-se a taxa de mutação da linhagem mutante D12 à da selvagem. Também será verificado se PA14_41070 está envolvido na metilação de DNA pelo uso de enzimas de restrição cuja atividade é inibida por metilação. Caso diferenças entre as linhagens sejam encontradas, sítios específicos de metilação serão determinados. A proteína codificada por PA14_41070 será purificada para ensaios in vitro de ligação e/ou metilação de DNA. Os produtos dos genes rnhA e dnaQ também poderão ser expressos e purificados para ensaios de interação proteína-proteína com o produto de PA14_41070. Caso não seja possível demonstrar a função de metiltransferase de DNA, ou sua interação com DnaQ ou RNase HI, outros ensaios serão realizados para verificar qual outro possível alvo para essa metiltransferase.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
NICASTRO, GIANLUCCA G.; KAIHAMI, GILBERTO H.; PEREIRA, THAYS O.; MEIRELES, DIOGO A.; GROLEAU, MARIE-CHRISTINE; DEZIEL, ERIC; BALDINI, REGINA L. Cyclic-di-GMP levels affect Pseudomonas aeruginosa fitness in the presence of imipenem. ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, v. 16, n. 5, p. 1321-1333, MAY 2014. Citações Web of Science: 7.

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