Biologia molecular aplicada à identificação de alvos para o controle do bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis

• Processo: 07/04748-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2008
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 2012
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Flavio Henrique da Silva
• Beneficiário: Fernando Fonseca Pereira de Paula
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Expressão de proteínas Proteínas recombinantes Bicudo da cana-de-açúcar Enzimas Peptídeo hidrolases Interferência de RNA Inativação gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bicudo da cana | cana-de-açúcar | Enzimas digestivas | peptidase | RNAi | SPHENOPHORUS levis | Expressão de proteínas recombinantes

Resumo

O bicudo da cana-de-açúcar, Sphenophorus levis, é um inseto que na fase larval se alimenta do rizoma da cana-de-açúcar cavando galerias que causam danos e levam à morte das plantas. Os métodos convencionais de controle disponíveis não têm sido eficientes contra esse inseto. O objetivo desse estudo foi gerar conhecimento sobre a Biologia e Fisiologia desse inseto em nível molecular utilizando uma abordagem transcriptômica para a identificação de possíveis genes alvo, visando futuros estudos para desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao ataque deste inseto. Após o processamento e montagem das sequências utilizando o programa dCAS, 3804 sequências foram agrupadas em 201 contigs e 1363 singlets, os quais foram manualmente anotados. Foram identificados diversos genes de degradação de parede celular, incluindo pectinases e celulases. Pela primeira vez um contig contendo uma sequência que codifica uma invertase foi identificado em um coleóptero. As prováveis enzimas digestivas totalizam 19,3% e os genes desconhecidos representam 28,8% do total de sequências expressas. Considerando a predominância de catepsinas L dentre as enzimas digestivas identificadas no transcriptoma (54,3%) e a sua importância para a hidrólise de proteínas nos processos digestivos, um clone de cDNA codificando uma catepsina L, denominado Sl-CathL, foi escolhido para a expressão recombinante em células de Pichia pastoris, caracterização e inibição in vitro utilizando a cistatina da cana-de-açúcar CaneCPI-4 (Ki = 0,196 nM). Os ensaios de imunolocalização evidenciaram a produção da Sl-CathL no epitélio do intestino médio e a secreção de vesículas, contendo a enzima, no lúmen do intestino. Larvas do inseto S. levis também apresentaram sensibilidade para disparar a maquinaria de RNA de interferência induzida por injeções de dsRNA na cavidade corpórea e o silenciamento gênico específico foi confirmado por RT-PCR. As larvas que receberam injeções com dsRNA da V-ATPase E morreram dentro de três semanas, enquanto as larvas que tiveram a serpina 1 silenciada exibiram atraso no desenvolvimento, aprisionamento na fase pupal, ou morreram como adultos farados. Desse modo, concluímos neste trabalho iniciado a partir da análise do transcriptoma, que a inibição da principal enzima digestiva pela Cane-CPI-4 e o silenciamento gênico via RNAi são alternativas promissoras para o estabelecimento de plantas resistentes ao inseto e podem ser aplicadas no desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar transgênicas com o objetivo de aumentar sua resistência ao Sphenophorus levis. (AU)