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Caracterização da interação entre proteínas não estruturais do vírus da febre amarela e eIF3S6IP

Processo: 08/01933-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2008
Vigência (Término): 31 de maio de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
Pesquisador responsável:Maurício Lacerda Nogueira
Beneficiário:Ana Theresa Silveira de Morais
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São José do Rio Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:04/11098-2 - Vírus da febre amarela: diagnóstico, aspectos moleculares e interferência de RNA, AP.JP
Assunto(s):Virologia   Interação proteína-proteína   Febre amarela

Resumo

Introdução. A febre amarela é uma doença causada pelo vírus da febre amarela (YFV-yellow fever virus), gênero Flavivirus, transmitido a vertebrados através da picada de vetores artrópodes. O genoma viral origina proteínas virais estruturais e não-estruturais (destaca-se a NS5, proteína mais conservada dentre os Flavivirus e que apresenta duas atividades essenciais durante a replicação viral, uma de RNA Polimerase dependente de RNA e outra de metiltransferase). Assim, interações entre proteínas celulares e a NS5 vêm sendo estudadas com o intuito de se compreender melhor o mecanismo de replicação e patogênese de vários membros da família Flaviviridae,e conseqüentemente para o desenho racional de drogas. Através de screening em sistema duplo-híbrido em levedura contra biblioteca de cDNA de células Hela, foi demonstrado através da ativação de genes repórteres que o domínio RNApol (Fragmento A) da NS5 interage com 33 proteínas celulares. Dentre outras, a proteína celular eIF3S6IP foi considerada de grande importância para estudos posteriores. Objetivos. Caracterizar a interação entre o domínio RNA polimerase da proteína N5S do vírus da febre amarela e a proteína celular eIF3S6IP, com mapeamento da interação, confirmação e localização da interação NS5-eIF3S6IP em culturas celulares e in vitro. Materiais e Métodos. 1)Mapeamento. A proteína eIF3S6IP será testada para interação com RNApol e Frag A(RNApol) em levedura. Será gerado um modelo estrutural do domínio RNApol para análise da localização do FragA. Para delimitar o domínio mínimo de interação entre RNApol e eIF3S6IP, o FragA será subdividido em três segmentos os quais serão amplificados e clonados em pGBKT7 para transformação seqüencial com pACT2- eIF3S6IP em ensaios de duplo-híbrido. Para avaliação dos resíduos críticos de NS5 para a interação com eIF3S6IP, será induzida mutações sítios dirigida em NS5 analisadas em duplo-híbrido.2)Interação em Culturas Celulares. Para confirmar que a interação NS5-eIF3S6IP forma um complexo in vivo, o teste de co-imunoprecipitação das proteínas NS5 e eIF3S6IP será realizado usando células Hela transfectadas com plasmídeos eIF3S6IOP-FLAG e NS5-HA e analisados por Western blotting. Para localizar a interação NS5-eIF3S6IP na célula, será realizado o teste de Imunofluorescência, usando plasmídeos eIF3S6IOP-FLAG e NS5-HA transfectados em células Hela. 3)Interação in vitro (GST-pulldown). A eIF3S6IP foi clonada num vetor contendo etiqueta GST e NS5 radiomarcada clonada num vetor contendo etiqueta HA. A proteína quimérica GST-eIF3S6IP será imobilizada em coluna seguida da adição de NS5 radiomarcada e a interação será analisada por Western blotting. 4) Expressão, purificação e renaturação in vitro da proteína eIF3S6IP. Será realizada a expressão em escala quantitativa para futuros ensaios de cristalização, caracterização por SAXS e sondas espectroscópicas. A proteína recombinante será, purificada por técnicas cromatográficas inicialmente por afinidade como, por exemplo, a resina níquel para proteínas His-tagged. Caso a proteína esteja presente como corpo de inclusão após a expressão, será feita uma solubilização com um tampão contendo uréia ou cloreto de guanidina e, então, submetida a métodos de purificação por cromatografia líquida. Em seguida, a amostra purificada será submetida às tentativas de reenovelamento usando um conjunto de soluções contendo uma variedade de aditivos através do método da diluição. A concentração da proteína será determinada através da medida de absorbância da mesma a 280 nm. Uma vez obtidas quantidades suficientes, as amostras serão submetidas à caracterização biofísica. A partir de técnicas espectroscópicas, serão analisadas as estruturas secundárias (dicroísmo circular) e terciárias da proteína (fluorescência).

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