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Estudo de interações proteicas da tiorredoxina peroxidase nuclear (nTPx) de Saccharomyces cerevisae nos eventos de crescimento celular e silenciamento telomérico

Processo: 09/04221-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de agosto de 2009
Vigência (Término): 31 de julho de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Carlos Alexandre Breyer
Instituição-sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:07/50930-3 - Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: uma investigação de mecanismos moleculares de catálise e da formação de complexos protéicos contendo dissulfetos mistos, AP.JP
Assunto(s):Crescimento celular   Biotecnologia

Resumo

As tiorredoxinas peroxidases (TPx), também denominadas de peroxirredoxinas (Prx) constituem um grupo de proteínas antioxidantes que vêm sendo bastante estudadas pela sua atuação na decomposição de diversos tipos peróxidos, como o H2O2, peroxinitritos e peróxidos de lipídeos. Assim como outras tiól oxirredutases, as TPxs são comuns na natureza, entretanto, diferentemente das demais, elas são encontradas nos mais diversos compartimentos celulares. Em S. cerevisiae já foram identificadas cinco isoformas, três são encontradas no citoplasma (cTPx I,cTPx II e cTPx III), uma na mitocôndria (mTPx I) e uma no núcleo (nTPx). A maioria das TPx de S. cerevisiae possui ortólogos em mamíferos, o que demonstra que esta levedura é um bom modelo para estudos funcionais dessas enzimas. A capacidade de decomposição de peróxidos pelas TPx está relacionada a presença em seu sítio ativo de um resíduo de cisteína de alta reatividade denominada de cisteína peroxidásica, o qual está envolvida diretamente na decomposição destes substratos. Em adição à atividade peroxidásica, algumas tiorredoxinas peroxidases de S. cerevisiae possuem atividade de chaperona molecular, detectada somente para cTPxI e cTPxII, sendo ativada em condições de estresse oxidativo e/ou de choque térmico e também estão envolvidas em processos de sinalização de crescimento celular que envolvem o peróxido de hidrogênio (H2O2). Já foi demonstrado que cTPxI é capaz de interagir diretamente com uma MAP quinase através da formação de um dissulfeto misto entre as duas proteínas. Tendo em vista a grande importância deste processos na homeostase celular chama a atenção a tiorredoxina peroxidase nuclear, em virtude de sua localização e grande abundância nesta organela (1840 moléculas/célula). A revisão da literatura demonstra a relevância desta proteína na manutenção do silenciamento dos telômeros e decomposição de peróxidos orgânicos no ambiente nuclear, e estudos em escala proteômica também indicam a associação direta de nTPx com MAP quinases. Apesar, dos dados descritos acima, a nTPx é a TPx menos estudada e entendida de S. cerevisiae. Este projeto tem por objetivo, a expressão e purificação de nTPx e de proteínas relacionadas a sinalização celular relacionada a crescimento celular ou manutenção do silenciamento telomérico (MEC3, GTS1, PCL1 e DOG2), capazes de interagir fisicamente com nTPx. A formação de complexos protéicos entre nTPx e as proteínas descritas acima será avaliado por PAGE nativo e ensaios com duplo híbrido. Também investigaremos a possível formação de dissulfetos mistos entre nTPx e as proteínas alvo deste estudo, através de eletroforese, cromatografia e espectrometria de massas. Acreditamos que os resultados esperados neste trabalho podem contribuir de forma significativa para o entendimento das relações de nTPx nos eventos de sinalização e manutenção dos telômeros. Adicionalmente, a padronização da expressão e purificação de nTPx e de proteínas capazes de estabelecer interações com esta, abre a perspectiva para experimentos de co-cristalização o que poderá permitir o entendimento detalhado de suas interações moleculares com seus parceiros biológicos.