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Produção dos fatores estimuladores de colônias de granulócitos (G-CSF) e de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) humanos recombinantes por Engenharia genética para a geração de biofármaco

Processo: 09/10171-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas - PIPE  
Vigência (Início): 01 de junho de 2009
Vigência (Término): 31 de maio de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Ana Claudia Oliveira Carreira Nishiyama
Beneficiário:Ana Claudia Oliveira Carreira Nishiyama
Empresa:Farmacore Biotecnologia Ltda (FARMACORE)
Vinculado ao auxílio:08/03030-0 - Produção dos fatores estimuladores de colônias de granulócitos (G-CSF) e de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) humanos recombinantes por engenharia genética para a geração de biofármacos, AP.PIPE
Assunto(s):Biotecnologia   Fator estimulador de colônias de granulócitos   Granulócitos   Macrófagos   Linhagem celular   Engenharia genética   Biofármacos   Citocinas

Resumo

Neste projeto propõe-se a geração de linhagens celulares superprodutoras dos fatores estimuladores de colônias de granulócitos (G-CSF) e de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) humanos recombinantes, produção de lote piloto e formulação dos produtos em sistemas micro/nanoparticulados de liberação controlada visando utilização como biofármacos no Brasil. Estes fatores peptídicos são amplamente utilizados para tratamentos de deficiência de glóbulos brancos, quimioterapia de pacientes portadores de AIDS e/ou câncer, transplante de medula óssea, aumento do número de células tronco hematopoiéticas em transplantes, degeneração cardíaca e pós-infarto e tratamento de leishmaniose cutânea severa. Para tanto, será utilizada a linhagem celular CHO-DG44 de ovário de hamster chinês, que é amplamente utilizada para a produção de proteínas humanas de interesse terapêutico, e a linhagem celular humana 293-F. O rhG-CSF e rhGM-CSF serão obtidos através da clonagem de seus cDNAs, no vetor bicistrônico pIQ-ID, construído no NUCEL-LBCM, para expressão através de transfecção estável de CHO-DG44 e otimização do rendimento através de cultura em suspensão em meio livre de soro. Será utilizada a estratégia de co-amplificação do locus gênico de interesse e do gene dhfr e seleção dos recombinantes com maior número de cópias por célula com metotrexato (MTX), que tem sido utilizada pelo grupo NUCEL, com grande sucesso, para a produção dos fatores de coagulação VIII e IX. Os cDNAs serão clonados, também, no vetor comercial pcDNA3.3-TOPO TA para expressão transitória em células 293-F de rim embrionáio humano, através do sistema de expressão FreeStyleTM 293 Expression System. Os produtos serão purificados para caracterização funcional e estrutural, através de ensaios bioquímicos, medidas de atividade biológica in vitro e in vitro, presença de sítios de N- e O-glicosilação e degradação protéica. Os clones superprodutores serão adaptados para crescimento em suspensão em meio sintético específico, visando o escalonamento da produção em biorreatores. Sistemas de liberação controlada nanoencapsulados serão testados para determinar o mais adequado para maior retenção na circulação do paciente. (AU)