Estudo de novas metodologias para realização de ensaios com a catepsina D na busca de inibidores

• Processo: 09/17538-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Vigência (Início): 01 de março de 2010
• Vigência (Término): 31 de janeiro de 2015
• Área do conhecimento: Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Orgânica
• Pesquisador responsável: Paulo Cézar Vieira
• Beneficiário: Vivian Estevam Cornélio
• Instituição Sede: Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia (CCET). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Produtos naturais Catepsina D Schistosoma mansoni Reatores biológicos Inibidores enzimáticos Ensaios enzimáticos Técnicas de microbalança de cristal de quartzo
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bioreatores | Catepsina D | Ensaios Enzimáticos | inibidores enzimáticos | microbalança de cristal de quartzo | Produtos Naturais | Produtos Naturais

Resumo

A catepsina D é uma aspartil endopeptidase envolvida em muitos processos patológicos quando expressa de forma desregulada. Além disso, é responsável pela degradação da hemoglobina ingerida por parasitos causadores da Esquistossomose. Por esses motivos a catepsina D é considerada um alvo importante na busca de inibidores. Os ensaios comumente realizados para avaliação da inibição dessa enzima monitoram produtos reacionais gerados a partir da clivagem de substratos peptídicos fluorogênicos ou a hemoglobina humana na presença de inibidores, que podem apresentar autofluorescência/absorbância nos mesmos comprimentos de onda utilizados. Considerando esta problemática, este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de quatro metodologias para a realização de ensaios com a catepsina D. Em duas metodologias os ensaios são realizados em solução, sendo que, em uma delas utiliza-se a catepsina D bovina isolada, e na outra se emprega um extrato de proteínas retirado de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Um terceiro ensaio foi desenvolvido para estudo de inibidores por meio do biorreator CatD-IMER acoplado a um sistema multidimensional no qual é possível monitorar a atividade da enzima imobilizada diretamente por meio da quantificação do produto formado. Por fim, a última metodologia foi desenvolvida imobilizando-se o substrato hemoglobina humana em cristal de quartzo. Sua hidrólise pela catepsina D foi avaliada por meio do uso da técnica de microbalança de cristal de quartzo, uma metodologia que monitora a atividade enzimática através de variações de massa. Nos ensaios enzimáticos foram avaliados 20 extratos de plantas, que levaram ao isolamento e identificação do alcaloide evolitrina, do composto 4-hidroxi-3-metoxicinamaldeído e dos flavonoides orientina e isovitexina. 31 compostos puros também foram ensaiados e, dentre estes, a substância (z)-2-(pentadec-5-enil)benzeno-1,4-diol apresentou atividade expressiva tanto frente à enzima isolada quanto em relação ao extrato de proteínas de S. mansoni. Para finalizar, a catepsina D recombinante de S. mansoni foi clonada e expressa em sistema E. coli, e ensaios in vitro com compostos isolados de produtos naturais mostraram excelentes resultados em relação ao limonoide cedrelona frente à esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

CORNELIO, VIVIAN E.; PEDROSO, MARIELE M.; AFONSO, ANDRE S.; FERNANDES, JOAO B.; DA SILVA, M. FATIMA G. F.; FARIA, RONALDO C.; VIEIRA, PAULO C.. New approach for natural products screening by real-time monitoring of hemoglobin hydrolysis using quartz crystal microbalance. Analytica Chimica Acta, v. 862, p. 86-93, MAR 3 2015. (09/17538-8)

CORNELIO, VIVIAN E.; MALUF, FERNANDO V.; FERNANDES, JOAO B.; DA SILVA, MARIA FATIMA G. F.; OLIVA, GLAUCIUS; GUIDO, RAFAEL V. C.; VIEIRA, PAULO C.. Isolation of Tiliroside from Spiranthera odoratissima as Inhibitor of Trypanosoma cruzi Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase by Using Bioactivity-Guided Fractionation. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 28, n. 3, SI, p. 512-519, MAR 2017. (09/17538-8, 13/07600-3)

CORNELIO, VIVIAN ESTEVAM; DE MORAES, MARCELA CRISTINA; DOMINGUES, VANESSA DE CASSIA; FERNANDES, JOAO BATISTA; DAS GRACAS FERNANDES DA SILVA, MARIA FATIMA; CASS, QUEZIA BEZERRA; VIEIRA, PAULO CEZAR. Cathepsin D immobilized capillary reactors for on-flow screening assays. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 151, p. 252-259, MAR 20 2018. (09/17538-8, 13/01710-1)