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Definição do perfil de alterações das sequências dos genes APC, CTNNB1, WT1, WTX e PLCG2 em Tumores de Wilms

Processo: 10/14841-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de novembro de 2010
Vigência (Término): 31 de julho de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica
Pesquisador responsável:Dirce Maria Carraro
Beneficiário:Bruna Durães de Figueiredo Barros
Instituição-sede: Hospital A C Camargo. Fundação Antonio Prudente (FAP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Biologia molecular   Genômica   Mutação   Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala   Genes supressores de tumor   Tumor de Wilms

Resumo

A diferenciação normal do rim é resultado de eventos moleculares coordenadamente regulados e mutação ou interrupção de qualquer um dos passos cruciais do processo de diferenciação pode levar à má-formação do rim resultando em doenças, incluindo o câncer. O Tumor de Wilms (TW) origina-se das células precursoras do rim embrionário e análises da Biologia Celular e Molecular dessa malignidade trouxeram informações importantes sobre o desenvolvimento renal inicial. Existem algumas evidências moleculares pertencentes a vias de sinalização celular estão envolvidos tanto na diferenciação do rim quanto com o aparecimento dos TWs, sugerindo que esses genes controlam ambos os processos. O gene WT1 codifica para um fator de transcrição com expressão finamente controlada durante o desenvolvimento do rim, e mutações nesse gene são relatadas em 10% dos TWs esporádicos. Adicionalmente, modulação do nível de expressão de outros genes como a CTNNB1 também desempenham papel crucial na nefrogênese, e mutações nesse gene, são relatados em cerca de 10% dos casos de TWs. Também são encontradas mutações de WTX em 10 a 30% dos casos de TWs. Atualmente, acredita-se que mutações de WTX, WT1 e CTNNB1 juntas estejam associadas a cerca de 30% dos TWs, sendo que ainda não foram associados genes para a maioria dos casos. Resultados de um projeto desenvolvido em nosso laboratório demonstraram que o nível de expressão é modulado durante a nefrogênese, e está alterado no TW, recapitulando os primerios estágios do desenvolvimento do rim, apontando os genes APC e PLCG2 como possíveis candidatos a desempenharem papel fundamental no aparecimento desse tumor. O APC está associado a diversos outros tipos de tumores, como por exemplo, o carcinoma colorretal, que apresenta mutação em mais de 80% dos casos, enquanto que o PLCG2 foi associado pela primeira vez a uma doença. Apesar de sua função fisiológica na célula ainda não ser bem descrita, sabe-se que está envolvido o aumento do cálcio intracelular. Com o advento de técnicas modernas de sequenciamento, velozes do ponto de vista de geração de bases e relativamente baratas, tornou-se factível a avaliação de toda a região que abrange o gene a um custo e tempo relativamente baixos. Com isso torna-se viável aplicar o método de sequenciamento de alto desempenho para avaliação de um grande número de pacientes. Nosso grupo vem estabelecendo protocolos de confecção de biblioteca, os quais as amostras podem ser marcadas individualmente de modo que se permita a avaliação de um conjunto de pacientes em uma única corrida de sequenciamento. Deste modo o objetivo desse estudo é definir alterações na sequência genômica correspondentes aos genes WTX, WT1, CTNNB1, APC e PLCG2, incluindo éxons e íntrons, em 54 amostras de TWs e 3 amostras não neoplásicas. Os cinco genes de interesse abrangem aproximadamente 430 Kb da região genômica. Até o momento conseguimos preparar os fragmentos referentes aos genes WTX, WT1 e CTNNB1 para 40 pacientes e estabelecer todas as etapas de metodologia de confecção das bibliotecas para sequenciamento paralelo de todos as amostras, assim nossa proposta é completar a amplificação dos fragmentos para os 5 genes em todos os 54 pacientes e submeter o conjunto de bibliotecas para o sequenciamento paralelo usando plataforma 454-Roche e analisar os dados para identificar as alterações. Assim nossa proposta é transformar esse projeto que inicialmente propunha encaixá-lo em um programa de mestrado, para um programa de doutorado, incluindo as etapas de validação técnica e biológica, além de correlacionar os dados de alteração no DNA com a expressão qualitativa e quantitativa dos transcritos. Os dados gerados, com resolução nucleotídica de uma região genômica de 430Kb onde estão mapeados os genes com evidências de estarem envolvidos com o apareciemto do TW, juntamente com analise detalhada de sua expressão, contribuirão para definição do espectro de mutação nesse tumor. (AU)