| Processo: | 10/14659-6 |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Mestrado |
| Data de Início da vigência: | 01 de março de 2011 |
| Data de Término da vigência: | 28 de fevereiro de 2013 |
| Área de conhecimento: | Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada |
| Pesquisador responsável: | Roxane Maria Fontes Piazza |
| Beneficiário: | Caio Raony Farina Silveira |
| Instituição Sede: | Instituto Butantan. São Paulo , SP, Brasil |
| Assunto(s): | Técnicas e procedimentos diagnósticos Testes imunológicos Escherichia coli enterotoxigênica Expressão gênica Anticorpos monoclonais |
| Palavra(s)-Chave do Pesquisador: | anticorpo monoclonal | clonagem scFv | diagnóstico | Etec | expressão | Imunodiagnóstico |
Resumo Amostras de Escherichia coli associadas à gastroenterite são conhecidas como Escherichia coli diarreiogênicas. Dentre elas destaca-se a E. coli enterotoxigênica (ETEC), responsável por cerca de 400 milhões de episódios de diarréia e 700.000 mortes de crianças com menos de cinco anos de idade anualmente, sendo também a principal causa da chamada "diarréia dos viajantes", que acomete turistas em trânsito em regiões onde a infeccção é endêmica. A identificação da ETEC tem sido feita através da detecção de seus principais fatores de virulência: as enterotoxinas termo-lábil (LT) e termo-estável (ST), através de técnicas de biologia molecular ou ensaios imunossorológicos. Quando comparados a outros métodos de detecção, os ensaios imunossorológicos apresentam diversas vantagens por serem testes rápidos, de fácil execução, incluindo alta especificidade e sensibilidade. Apesar dos anticorpos monoclonais apresentarem diversas qualidades, como homogeneidade e especificidade, além do fato de serem produzidos ilimitadamente, a produção desses anticorpos requer o uso de animais, cultura de células especializadas e um extensivo envolvimento de tempo e trabalho. Uma alternativa para substituí-los é a obtenção de um anticorpo recombinante, objetivo deste trabalho, com sensibilidades e afinidades desejáveis, que possam ser produzidos com baixo custo e em larga escala. Esta abordagem requer a clonagem e expressão das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo unidas por um polipeptídeo flexível (linker). Após extração de RNA total de hibridomas produtores de anticorpos anti-ST e transcrição reversa, as cadeias leve e pesada foram amplificadas por PCR e unidas por um linker de DNA para obtenção do inserto scFv-ST. Após sequenciamento, um gene sintético foi sintetizado, com otimização de códons para expressão em cepas de Escherichia coli. No presente projeto esse gene será amplificado e subclonado em vetor de expressão e células E. coli serão transformadas com o plasmídio recombinante que serão induzidas para sua expressão e caracterização quanto a sua funcionalidade e estrutura, uma vez obtida, essa molécula deverá ser utilizada como ferramenta na detecção de ETEC. (AU) | |
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