Investigação da localização subcelular da quinase de adesão focal (FAK) e sua forma mutada (FAKY397F) em cardiomiócitos in vitro e em corações de camundongos transgênicos

• Processo: 10/17086-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Vigência (Início): 01 de março de 2011
• Vigência (Término): 31 de dezembro de 2012
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Kleber Gomes Franchini
• Beneficiário: Sílvio Roberto Consonni
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Médicas (FCM). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 06/54878-3 - Patogênese da hipertrofia e insuficiência cardíacas: mecanismos ativados por estimulo mecânico, AP.TEM
• Assunto(s): Morfologia (anatomia) Cardiomegalia Quinase 1 de adesão focal Cardiologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cardiomiócitos | Hipertrofia cardíaca | Morfologia | Quinase de adesão focal (FAK) | Cardiologia

Resumo

Há um crescente avanço no desenvolvimento das tecnologias que permitam a localização de proteínas em células por microscopias de luz e eletrônica combinadas, com o uso das sondas moleculares miniSOG e Apex2, por exemplo. Adicionalmente busca-se compreender como proteínas são responsáveis pelas funções celulares e teciduais. A Quinase de Adesão Focal (FAK), proteína da cascata de sinalização das integrinas é considerada uma mediadora em potencial do estresse mecânico nos cardiomiócitos. Sabe-se que em cardiomiócitos submetidos a estímulos hipertróficos, ocorre rápida ativação da FAK e sua redistribuição subcelular, contudo são pouco conhecidos os mecanismos envolvidos nesses processos. Outra proteína de grande importância no coração é a Calsarcina-1 (CS1), regulador negativo da via de Calcineurina, crucial no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. Entretanto os mecanismos envolvidos nessa regulação negativa, assim como a distribuição subcelular de CS1 são pouco conhecidos. Visando à interação entre essas áreas para estudo da distribuição espaço-temporal dos componentes celulares e de proteínas, bem como a importância da FAK e CS1 no sarcômero e seu papel na sinalização hipertrófica sob estímulo mecânico, o objetivo geral desse trabalho foi explorar a capacidade das proteínas FAK e CS1 para incorporar geneticamente sondas moleculares que permitissem monitorar por meio de imagens o comportamento dessas moléculas-chave na biologia do disco Z em MVRNs submetida ao estiramento mecânico. Para isso, foram realizados ensaios de localização subcelular com uso de sondas moleculares aplicadas à microscopia correlativa, bem como ensaios bioquímicos, moleculares e de atividade enzimática. Os dados confirmaram a FAK associada às fibras de actina e adesões focais em células H9c2 e foi demonstrado à microscopia de luz que FAK wild-type (wt) translocou-se parcialmente para o compartimento nuclear após estimulação do agonista fenilefrina, enquanto que FAK Y397F (forma mutante inativa) não apresentou mesmo fenótipo. Por outro lado, apesar da padronização e expressão das construções com FAK e miniSOG ou Apex2 em células HEK 293T e H9c2, não foi conclusiva a localização subcelular da FAK, por meio do uso de microscopia eletrônica em MVRN. Provavelmente devido à distribuição difusa da maior parte das moléculas de FAK, não foi identificada uma região elétron-densa conclusiva à microscopia eletrônica de transmissão. No tocante à importância da CS1, observou-se que o estiramento cíclico não induziu o aumento na expressão proteica ou gênica relativa de CS1 e CnA, assim como não houve alteração na atividade fosfatase de CnA. No entanto houve redução da interação de CS1 e CnA, bem como alteração na localização de CS1 em MVRN sob estímulo mecânico. Dados de superexpressão e silenciamento de CS1 corroboram a regulação negativa de CS1 à CnA em MVRN sob estímulo mecânico. Baseando-se em dados estruturais, especulou-se que como o sítio de ligação de NFAT e CS1 à CnA são muito próximos e ao mesmo tempo distante do sítio ativo da fosfatase, é possível que o papel de CS1 na regulação negativa de CnA ocorra por impedimento espacial ao fator de transcrição NFAT. Portanto, esses resultados podem contribuir para uma possível inferência farmacológica, visto que a via de Calcineurina-NFAT é uma das principais mediadoras de hipertrofia em cardiomiócitos, mediante estímulos patológicos. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

CONSONNI, SILVIO R.; DE CARVALHO, ANNA C. P. V.; MAURO, ARTUR B.; FRANCHINI, KLEBER G.; BAJGELMAN, MARCIO C.. Lentiviral transduction of neonatal rat ventricular myocytes preserves ultrastructural features of genetically modified cells. VIROLOGY, v. 562, p. 190-196, OCT 2021. (17/21720-2, 19/04458-8, 10/17086-7, 12/13132-0)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

CONSONNI, Sílvio Roberto. Localização e função de quinase de adesão focal e Calsarcina-1 em cardiomiócitos de ratos: emprego de sondas moleculares e lentivírus. 2015. Tese de Doutorado - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia Campinas, SP.