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Clonagem e expressão dos domínios desintegrina e rico em cisteína (DC) da ADAM 9 (a Disintegrin and Metalloproteinase) humana em Pichia Pastoris

Processo: 10/19493-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de fevereiro de 2011
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo
Beneficiário:Ana Carolina Ferreira Cardoso
Instituição-sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:98/14138-2 - Center for Structural Molecular Biotechnology, AP.CEPID
Assunto(s):Proteínas   Desintegrinas   Pichia pastoris   Expressão gênica

Resumo

As ADAMs possuem funções importantes em muitos processos fisiológicos, participando da clivagem de ectodomínios de proteínas de membrana, fertilização, fusão de mioblastos, migração, proliferação, sobrevivência celular, entre outros processos. Esta família de proteínas possui os domínios citoplasmático, transmembrana, EGF-like, rico em cisteína, desintegrina, metaloprotease, pró-domínio e um peptídeo sinal. Cada um destes domínios, além de funções estruturais, possui funções específicas na fisiologia da célula normal e também em estados patológicos, como o câncer. Por isso a importância da produção recombinante de seus domínios, como o desintegrina e rico em cisteína, para a melhor compreensão das funções e especificidade das ADAMs quanto a sua característica de molécula de adesão. Este projeto tem como objetivo a clonagem, expressão e purificação dos domínios desintegrina e rico em cisteína (DC) da proteína ADAM9 humana (A Disintegrin And Metalloprotease). Tal processo de produção do domínio recombinante será realizado no sistema de levedura Pichia pastoris, o qual fornece inúmeras vantagens sobre a utilização do sistema bacteriano, entre elas a realização de modificações pós-traducionais e a produção de altos níveis de proteínas recombinantes. O cDNA correspondente à ADAM9DC será clonado no vetor de expressão pPICZ± e expresso em Pichia pastoris. O produto da expressão (ADAM9DC) será purificado por cromatografia de afinidade, com a utilização de resina de níquel e, posteriormente, será analisada a pureza por SDS-PAGE e a sua atividade será testada por meio do ensaio de invasão celular, realizado em células tumorais de mama da linhagem MDA-MB-231.