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Análise da necessidade da interação Orc1/Cdc6 ATP para a ligação de Orc1/Cdc6 ao DNA nuclear em tripanosomas

Processo: 11/01724-7
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2011
Vigência (Término): 31 de março de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Maria Carolina Quartim Barbosa Elias Sabbaga
Beneficiário:Ellen Mesquita Silva
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Parasitos   Replicação do DNA   Leveduras   Proteínas recombinantes   Maquinaria   Mutação   Transfecção

Resumo

Para que a replicação do DNA genômico se inicie, é preciso que a maquinária de pré-replicação reconheça no DNA regiões que atuem como origens de replicação, nucleando assim o processo em pontos específicos do DNA. Em leveduras, a maquinaria de pré-replicação é composta pelo complexo Orc (Orc 1-6), Cdc6, Cdt1 e o complexo MCM (2-7). A associação de Orc à origem de replicação possibilita a interação desta com ambas proteínas Cdc6 e Cdt1. Orc, Cc6 e Cdt1 agem juntas para estabilizar o complexo MCM nas origens. Em células de leveduras, a ligação de Orcs ao ATP é pré-requisito para que estas interajam com as origens de replicação do DNA genômico. Nosso grupo demonstrou recentemente que a proteína Orc1/Cdc6, homologa tanto a Orc1 quanto a Cdc6, é um componente da maquinaria de pré-replicação nos tripanosomas. A sequência primária de Orc1/Cdc6 de T. cruzi e T. brucei apresenta um sítio de interação a ATP/GTP e nosso laboratório demonstrou que essas proteínas recombinantes ligam ATP "in vitro". Assim, podemos avaliar, neste projeto, se a interação de Orc1/Cdc6 a ATP é também necessária em tripanosomas para interação desta molécula ao DNA. Essa informação, além de acrescentar informação sobre a biologia da replicação do DNA em tripanosomas, abrirá a perspectiva de um possível alvo de droga nestes parasitas. Para tanto, pretendemos gerar um gene Orc1/Cdc6 contendo uma mutação pontual no sítio ligante ao ATP. Esses genes (de T. cruzi e T. brucei) serão clonados em vetores específicos para transfecção em ambos os parasitas. As proteínas mutadas conterão um domínio tag para ser discriminada da endógena e a interação das proteínas mutantes ao DNA serão analisadas por extrato diferencial, técnica já padronizada que diferencia as proteínas solúveis das ligadas ao DNA. A capacidade de replicação dos parasitas transfectados também será analisada por citometria de fluxo.

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