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Nanobiotecnologia aplicada a biomineralização: reconstituição de multi-proteínas em lipossomos

Processo: 11/00633-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de maio de 2011
Vigência (Término): 30 de abril de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Pietro Ciancaglini
Beneficiário:Ana Maria Sper Simão
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Fosfatase alcalina   Nanobiotecnologia   Biomineralização

Resumo

O processo de biomineralização consiste no acúmulo de mineral constituído principalmente por íons de fosfato e cálcio que formam um sal de fosfato de cálcio, o qual subseqüentemente estrutura-se em hidroxiapatita. Este processo é mediado por osteoblastos, células que são responsáveis pelo início do processo de biomineralização, mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs). Estas vesículas surgem por brotamento das superfícies das células e são secretadas no local específico do início da biomineralização na matriz do tecido ósseo. MVs contém altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a quatro famílias de proteínas presentes nas MVs: as anexinas (AnxAs), as fosfatases alcalinas não-específicas de tecido (TNAPs), as proteínas transportadoras de Pi (PiT) e a nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase-1 (NPP1). Todas estas enzimas/proteínas regulam a formação dos cristais de fosfato de cálcio, atuando assim diretamente no processo de mineralização óssea. Dentre as anexinas, especificamente a Anexina V, uma proteína de ~35 kDa, é responsável pela formação de canais de cálcio através de sua associação tanto com a face externa quanto interna da membrana das MVs. As anexinas também são responsáveis pela desorganização da membrana celular, que por sua vez resulta no processo de apoptose. A TNAP é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação. Está inserida à membrana plasmática das MVs por uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e é denominada "alcalina" por sua habilidade de efetuar estas reações de hidrólises de substratos mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). Recentemente, foi verificado em nosso laboratório que as propriedades catalíticas da TNAP variam dependendo do microambiente onde a enzima se encontra. Além disso, a TNAP tem um papel crucial em limitar a concentração de pirofosfato inorgânico extracelular (ePPi), um potente inibidor da mineralização, para manter uma razão Pi/PPi adequada para a mineralização óssea normal. A função primária da TNAP é degradar o ePPi, que é produzido ectoplasmicamente pela NPP1. Dentre as PiT, proteínas que realizam o transporte de Pi dependente de Na+, impulsionado por um gradiente de Na+ direcionado para o interior da célula, a PiT-1 está envolvida tanto no metabolismo de Pi ósseo quanto em processos de calcificação patológica. Todas estas proteínas/enzimas agem ao nível da membrana de osteoblastos e de MVs derivadas de osteoblastos. Assim, pretendemos estudar o envolvimento das proteínas (TNAP, NPP1, PiT-1 e Anexina V) e de lipídios no processo de biomineralização, utilizando sistemas vesiculares artificiais de proteolipossomos que mimetizem a função das MVs neste processo. Para isso, este projeto tem como objetivo principal a utilização da nanobiotecnologia para a construção de sistemas de proteolipossomos contendo TNAP, NPP1, PiT-1 e/ou Anexina V, para se estudar a associação entre as diferentes proteínas e avaliar tanto a dependência da atividade da TNAP quanto a formação de cristais de hidroxiapatita em função da presença destas proteínas associadas. Tais estudos ajudarão a desenvolver e validar o sistema de proteolipossomos como um sistema in vitro alternativo para se estudar os eventos iniciais que induzem o processo de calcificação biológica. O desenvolvimento de tal sistema nanovesicular artificial que possa mimetizar a calcificação biológica poderá potencialmente ser útil para o reparo/tratamento de defeitos craniofaciais e outros defeitos esqueléticos, bem como para facilitar a mineralização de implantes dentários baseados em titânio.