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Uso de HPLC acoplado a detector UV-Vis e eletroquímico para análise e quantificação de compostos em amostras biológicas

Processo: 08/03584-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de abril de 2008
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
Pesquisador responsável:Eduardo Alves de Almeida
Beneficiário:Carlos Eduardo Fossa
Instituição-sede: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de São José do Rio Preto. São José do Rio Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:06/03873-1 - Estudo de variações bioquímicas em tilápias, como biomarcadores de contaminação ambiental, AP.JP
Assunto(s):Glutationa   Cromatografia líquida de alta pressão   Melatonina   Peroxidação de lipídeos

Resumo

Recentemente nosso laboratório adquiriu um sistema de HPLC com detectores UV/Vis e eletroquímico, o qual será utilizado com bastante regularidade para quantificação de determinados compostos em amostras biológicas provenientes de experimentos realizados por nosso grupo. Nossas pesquisas envolvem a exposição de peixes a poluentes ambientais modelo, para verificação das respostas destes organismos a estes compostos. Além disso, temos colaboração com diversos grupos de pesquisa dentro e fora de nossa instituição, onde avaliamos determinados parâmetros bioquímicos em distintos animais, incluindo outras espécies de peixes, anfíbios anuros, quelônios, quirópteros e humanos. Nestes organismos, medimos diferentes parâmetros, correlacionando os valores encontrados com o modelo experimental testado em cada organismo. Para se medir muitos dos compostos propostos, tais como níveis de glutationa reduzida e oxidada, melatonina, lesão em DNA e membranas, metalotioneínas entre outros, necessita-se a técnica de HPLC, acoplado a detector UV-Vis, ou eletroquímico. Esta técnica, assim como o equipamento, requer uma série de conhecimentos específicos, de forma a se obterem cromatogramas com boa separação, boa relação sinal/ruído, picos bem definidos, etc. Isto envolve conhecimentos sobre as melhores colunas a serem utilizadas, fase móvel, fluxo, etc, o que por conseqüência também requer um bom domínio do funcionamento do equipamento e sua manutenção, visando otimizar sua vida útil e evitar problemas relacionados a mau uso. Para tanto, foi solicitada a presente bolsa, para treinar um aluno graduado em química, ciências biológicas, ou áreas afins, para ensiná-lo formas de se manusear o equipamento, fazer a manutenção preventiva de suas partes (pistões de bombas, limpeza de colunas, limpeza da célula eletroquímica, etc.) assim como de se otimizar técnicas e protocolos de separação e quantificação de compostos em HPLC. Inicialmente, o estagiário escolhido será treinado por mim, através da aplicação de diferentes técnicas de meu domínio com o equipamento. Encarregarei-me de ensiná-lo sobre todo funcionamento do equipamento e suas partes, e quais variáveis podem influenciar na separação e detecção de diferentes compostos, nos distintos tipos de detectores. Será explicado também sobre os diferentes tipos de fase móvel a se utilizar, a importância do preparo adequado das amostras, e como fazer curvas de calibração para a quantificação de compostos em amostras biológicas. No caso de novos compostos a serem detectados por HPLC-EC, será ensinado também, como se constrói um voltamograma para estabelecimento dos melhores potenciais eletroquímicos a serem aplicados no detector EC. Este aluno deverá iniciar uma série de testes para se habituar à utilização do equipamento, usando amostras de teste. Serão ensinadas também, algumas precauções a serem tomadas com o equipamento, evitando possíveis danos que necessitem reparo, e algumas formas para se diagnosticar problemas referentes ao aparelho, tais como vazamentos nos pistões, nas conexões entre tubulações, problemas relacionados a aumento de pressão nas colunas, entre outros. Uma vez treinado, o estagiário deverá trabalhar em conjunto com alunos de IC e pós-graduação que trabalham sob minha orientação, auxiliando-os no uso do HPLC.