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Bases neuroquímicas dos efeitos da eletroacupuntura em camundongos submetidos a modelos animais de dependência ao etanol: sistema opióide, AMPc, PKA, pCREB e BDNF

Processo: 08/10024-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de junho de 2008
Vigência (Término): 30 de abril de 2009
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Pesquisador responsável:Angela Maria Florencio Tabosa
Beneficiário:Thiago Nogueira de Carvalho
Instituição-sede: Departamento de Ortopedia e Traumatologia. Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:07/55458-0 - Bases neuroquímicas dos efeitos da eletroacupuntura em camundongos submetidos a modelos animais de dependência ao etanol: sistema opióide, AMPc, PKA, pCREB e BDNF, AP.R
Assunto(s):Imuno-histoquímica   Dependência   Eletroacupuntura

Resumo

Estudos histológicosPassadas 2 horas da finalização do teste comportamental, os animais serão anestesiados profundamente com uma dose de tionembutal 50 mg/kg, i.p., sendo então submetidos à perfusão intracardiaca. Inicialmente a perfusão será realizada com solução salina tamponada em velocidade média de 7 mL/min por aproximadamente 15 minutos. Logo após, a perfusão prosseguirá com a administração de paraformaldeido a 2 %. Os encéfalos serão retirados e mantidos em uma solução de sacarose à 30 % por 24 horas. Serão obtidas secções encefálicas coronais de 30 mm de espessura, ao longo do eixo septo-temporal, que serão armazenadas a -6 ºC em recipientes contento solução anti-congelamento, até o processamento de imunofluorescência. Cortes adjacentes aos utilizados para a marcação de cada imunohistoquímica serão corados com Cresil violeta para identificação anatômica das áreas encefálicas. Para a contagem das células positivas para cada imunofluorescência, a nomenclatura e os limites das estruturas encefálicas serão definidos de acordo com o Atlas estereotáxico de camundongos.Procedimentos de imunofluorescênciaOs cortes serão incubados com HCl, H2O2, e lavados em PBS. Em seguida serão bloqueados por 30 minutos em "blocking buffer" (BB) (90ml de PBS 0,1M, 250ml de Triton X-100, 450ml de soro normal de cabra) em temperatura ambiente. Após, serão incubados "over night" com anticorpo anti-BDNF 1:100 (Promega) ou anti-DARPP-32 1:300 (Chemicon) ou anti-pCREB 1:100 (Sigma), diluídos em BB e então, com o seus respectivos secundários.A fim de elucidar a ativação da via AMPc / PKA / pCREB / BDNF, a interação das células BDNF ou DARPP-32 ou pCREB positivas será avaliada por dupla marcação. Neste sentido, será seguido o mesmo protocolo de lavar e desnaturar o DNA como descrito acima. Após isso, os cortes serão incubados em BB por 30 minutos, seguido por anti-BDNF ou anti-DARPP-32 ou anti-pCREB por duas horas à temperatura ambiente (de forma a avaliar a dupla-marcação de BDNF x DARPP-32, BDNF x pCREB e DARPP-32 x pCREB. Os cortes serão então, lavados com PBS por três vezes de 10 minutos e incubados com os respectivos secundários: Alexa Fluor® 488 de cabra anti-rato IgG (1:300, Molecular Probes), Alexa Fluor® 546 de cabra anti-camundongo IgG (1:300, Molecular Probes), Alexa Fluor® 546 de cabra anti-coelho IgG (1:300, Molecular Probes) e Alexa Fluor anti-cabra IgG (1:300, Molecular Probes), por uma hora à temperatura ambiente. Os cortes serão por fim montados com Fluoromount G® (Electron Microscopy Sciences, PA, USA) e cobertos com lamínulas. Utilizando um microscópio de fluorescência e/ou confocal (Carl Zeiss LSM510, Germany) será possível diferenciar as células que co-expressão BDNF x DARPP-32, BDNF x pCREB e DARPP-32 x pCREB.