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O fator sigma da RNA polimerase em linhagens de Escherichia coli enteropatogênica

Processo: 09/07489-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de junho de 2009
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Beny Spira
Beneficiário:Ana Lívia da Silva Ferreira
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:09/00109-7 - Fator sigmaS da RNA polimerase em linhagens de Escherichia coli diarreiogênicas, AP.R
Assunto(s):Fator sigma

Resumo

Plano de Atividades: A) Expressão de rpoS, sua relação com gadX e a patogenicidade de EPECO gene gadX codifica uma proteína reguladora da enzima glutamato descarboxilase que está envolvida na resposta bacteriana ao estresse causado por pH ácido. O promotor deste gene é reconhecido por ÃS. GadX também afeta negativamente a expressão do operon per que por sua vez ativa direta- ou indiretamente a expressão das adesinas Bfp e intimina. É razoável supor, portanto, que alterações no nível de RpoS (causadas por mutações ou pela super-expressão da proteína) afetem a transcrição de gadX, que consequentemente altera a expressão das adesinas de EPEC.Para testar esta hipótese, será introduzida uma mutação em gadX nas cepas E2348/69 e LRT9 e em seus respectivos mutantes rpoS. O gene rpoS será clonado em um plasmídio de expressão, que será transformado nas cepas acima. O efeito das mutações rpoS e gadX, em conjunto ou separadamente, sobre a expressão de bfp, eae e per será testado. B) Polimorfismo de rpoS em cepas de EPECResultados preliminares demonstraram que o status de rpoS em cepas de EPEC varia de forma significativa. Variações intrínsecas no status de rpoS têm uma influência profunda sobre a alocação de recursos transcricionais na célula bacteriana, podendo inclusive afetar a expressão de genes de virulência. Um exemplo típico seria o caso de gadX, discutido acima: ao penetrar no organismo pela via oral, o ambiente ácido do estômago estimula o acúmulo de RpoS, que por sua vez transcreve gadX, que inibe per impedindo desta forma que as adesinas sejam expressas antes da hora, ou seja, quando ainda no estomago.Para avaliar o polimorfismo de rpoS e possíveis diferenças nos níveis de expressão da proteína serão realizados os seguintes experimentos: O status de rpoS em diversas cepas de EPEC será medido de forma direta ou indireta tanto através de ensaios de western-blot com anticorpos anti-RpoS como através da quantificação da expressão de genes dependentes de RpoS, tais como katE (que codifica catalase) ou proU (operon que codifica um transportador de glicina e prolina) e genes negativamente afetados por RpoS, como phoA (que codifica fosfatase alcalina). Serão investigadas cepas de EPEC de origem humana e animal. Os genes rpoS das amostras de EPEC serão sequenciados para detectar a presença de mutações que costumam ser bastante freqüentes neste gene. Para verificar se há uma relação entre o tipo de rpoS e fatores de virulência em isolados naturais, serão testados os níveis de produção de fatores de virulência representativos tal como bfp.. (AU)