Producao dos fatores estimuladores de colonias de granulocitos (g-csf) e de granulocitos e macrofagos (gm-csf) humanos recombinantes por engenharia genetica para a geracao de biofarmaco

• Processo: 10/09356-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2010
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2011
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Ana Claudia Oliveira Carreira Nishiyama
• Beneficiário: Raquel Santana da Cruz
• Vinculado ao auxílio: 08/03030-0 - Produção dos fatores estimuladores de colônias de granulócitos (G-CSF) e de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) humanos recombinantes por engenharia genética para a geração de biofármacos, AP.PIPE
• Assunto(s): Citocinas Biofármacos Biotecnologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biofármaco | Células de Mamífero | citocinas | Fator Estimulador de Colônia de Granulócito | Fator Estimulador de Colônia de Granulócito e Monócito | G-CSF e GM-CSF | Biotecnologia

Resumo

Neste projeto propõe-se a geração de linhagens celulares superprodutoras dos fatores estimuladores de colônias de granulócitos (G-CSF) e de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) humanos recombinantes, produção de lote piloto e formulação dos produtos em sistemas micro/nanoparticulados de liberação controlada visando utilização como biofármacos no Brasil. Estes fatores peptídicos são amplamente utilizados para tratamentos de deficiência de glóbulos brancos, quimioterapia de pacientes portadores de AIDS e/ou câncer, transplante de medula óssea, aumento do número de células tronco hematopoiéticas em transplantes, degeneração cardíaca e pós-infarto e tratamento de leishmaniose cutânea severa. Para tanto, será utilizada a linhagem celular CHO-DG44 de ovário de hamster chinês, que é amplamente utilizada para a produção de proteínas humanas de interesse terapêutico, e a linhagem celular humana 293-F. O rhG-CSF e rhGM-CSF serão obtidos através da clonagem de seus cDNAs, no vetor bicistrônico pIQ-ID, construído no NUCEL-LBCM, para expressão através de transfecção estável de CHO-DG44 e otimização do rendimento através de cultura em suspensão em meio livre de soro. Será utilizada a estratégia de co-amplificação do locus gênico de interesse e do gene dhfr e seleção dos recombinantes com maior número de cópias por célula com metotrexato (MTX),que tem sido utilizada pelo grupo NUCEL, com grande sucesso, para a produção dos fatores de coagulação VIII e IX. Os cDNAs serão clonados, também, no vetor comercial pcDNA3.3-TOPO TA para expressão transitória em células 293-F de rim embrionáio humano, através do sistema de expressão FreeStyleTM 293 Expression System. Os produtos serão purificados para caracterização funcional e estrutural, através de ensaios bioquímicos, medidas de atividade biológica in vitro e in vitro, presença de sítios de N- e O-glicosilação e degradação protéica. Os clones superprodutores serão adaptados para crescimento em suspensão em meio sintético específico, visando o escalonamento da produção em biorreatores. Sistemas de liberação controlada nanoencapsulados serão testados para determinar o mais adequado para maior retenção na circulação do paciente.