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Análise da importância da atividade de ATPase de Orc/Cdc6 de tripanossomas para a estabilidade do complexo de pré replicação do DNA

Processo: 11/05187-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2011
Vigência (Término): 31 de agosto de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Maria Carolina Quartim Barbosa Elias Sabbaga
Beneficiário:Daiane da Rocha Soares
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Replicação do DNA

Resumo

Para que a replicação do DNA genômico se inicie, é preciso que a maquinaria de pré-replicação (MPR) reconheça no DNA regiões que atuem como origens de replicação, nucleando assim o processo em pontos específicos do DNA. Em leveduras, a MPR é composta pelo complexo ORC (Orc 1-6), Cdc6, Cdt1 e o complexo MCM (Mcm 2-7). A associação de ORC à origem de replicação possibilita a interação desta com ambas proteínas Cdc6 e Cdt1. ORC, Cdc6 e Cdt1 agem juntas para estabilizar o complexo MCM nas origens. Em células de leveduras, a ligação de Orcs ao ATP é pré-requisito para que estas interajam com as origens de replicação do DNA genômico. Mais que isto, a hidrólise do ATP por Orcs e Cdc6 garantem a interação específica entre o DNA e a MPR e estabilizam o complexo MCM na MPR. Nosso grupo demonstrou recentemente que a proteína Orc1/Cdc6, homóloga tanto a Orc1 quanto a Cdc6, é um componente da MPR nos tripanosomas. A seqüência primária de Orc1/Cdc6 de T. cruzi e T. brucei apresenta as regiões sensor 1 e 2 fundamentais para atividade de ATPase. Nosso laboratório demonstrou que estas proteínas recombinantes hidrolisam ATP "in vitro" e que a atividade de ATPase aumenta na presença de DNA inespecífico. Neste sentido, o objetivo deste projeto é avaliar a importância da hidrólise de ATP para a formação e estabilidade da maquinaria de pré-replicação no genoma de tripanosomas. Para tanto, pretendemos gerar proteínas recombinantes Orc1/Cdc6 de T. cruzi e T. brucei mutadas nas regiões sensor 1 ou 2 que sejam incapazes de hidrolisar ATP. Estes genes serão então clonados em vetores de expressão indutíveis para transfecção em células de T. brucei e T. cruzi. Finalmente, as células expressando Orc1/Cdc6 mutadas serão avaliadas quanto a (i) estabilidade da interação Orc1/Cdc6 - DNA, (ii) capacidade de estabilizar MCM no DNA, (iii) capacidade de replicar seu DNA. (AU)