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Investigação dos determinantes moleculares envolvidos na interação com os substratos de Tsa1 e Tsa2 de Saccharomyces Cerevisiae

Processo: 11/13500-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de outubro de 2011
Vigência (Término): 30 de setembro de 2015
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Carlos Alexandre Breyer
Instituição-sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Assunto(s):Estresse oxidativo   Peroxirredoxinas

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) são proteínas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos e tem se destacado devido sua eficiência catalítica, alta abundância e distribuição nos diversos compartimentos celulares. As Prx são capazes de reduzir seus substratos utilizando um resíduo de cisteína altamente reativa localizada em seu sítio ativo, denominada de cisteína peroxidásica (CP-SH), a qual no processo de decomposição de peróxidos é oxidada a cisteína ácido sulfênico (CP-SOH). Em Saccharomyces cerevisiae, há duas isoformas citosólicas de Prx (Tsa1 e Tsa2), que possuem grande semelhança (86% de identidade e 96% de similaridade). Em adição à atividade peroxidásica, já foi demonstrado que as enzimas Tsa1 e Tsa2 possuem atividade de chaperona; entretanto, a concentração intracelular dessas proteínas varia significativamente. Enquanto Tsa1 apresenta ~378000 moléculas por célula, Tsa2 possui somente 4800 na fase log de crescimento. Desta forma, tem-se postulado que apesar da grande semelhança, Tsa1 estaria envolvida principalmente na defesa celular em reposta a insultos oxidativos ou térmicos, ao passo que Tsa2 teria um maior envolvimento na transdução de sinal, em eventos como crescimento e apoptose. Já foi demonstrado que ambas as enzimas podem ser reduzidas pelas tiorredoxinas citosólicas (Trx1 e Trx2). Assim como as Prx citosólicas, Trx1 e Trx2 compartilham elevada semelhança nas suas estruturas primárias (78% de identidade e 89% de similaridade) e muitas vezes são consideradas proteínas redundantes. Entretanto, nenhum estudo até o momento atentou para verificar se as taxas de redução Tsa1 e Tsa2 são equivalentes entre si quando se utiliza Trx1 ou Trx2. Recentemente foi determinada a estrutura de Tsa1 e a análise de sua estrutura revela que 27 dos 28 aminoácidos que a diferem de Tsa2 se encontram na superfície da molécula, o que sugere interações particulares com as Trx citosólicas. Este projeto tem como objetivos efetuar análises sistemáticas das relações moleculares de Tsa1 e Tsa2 com Trx1 e Trx2, o qual deve resultar em um maior entendimento nos processos de redução/superoxidação de Tsa1 e Tsa2 e, consequentemente, nos processos celulares em que estas proteínas participam. Para tanto, pretendemos determinar a estrutura de Tsa2 no estado reduzido e oxidado em dissulfeto visando o entendimento em detalhe de suas diferenças com Tsa1 e relações moleculares com seus substratos. Também será efetuada a avaliação comparativa das taxas de redução de Tsa1 e Tsa2 por Trx1 ou Trx2, por meio do ensaio de oxidação do NADPH. As taxas de redução influenciam decisivamente na superoxidação, oligomerização e função de chaperona de Tsa1 e Tsa2, estas serão avaliadas por meio de western blot (WB) utilizando anticorpos específicos para formas superoxidadas (in vitro e in vivo), cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Para maior aprofundamento na investigação, serão realizadas mutações sítio dirigidas individuais/combinatórias de aminoácidos de Tsa2 presentes na superfície de interação Tsa/Trx. As mutações substituirão aminoácidos em Tsa2 por seus correspondentes que ocupam a mesma posição em Tsa1 (Tsa2(S45T), Tsa2(K97N) e Tsa2(D150N).

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
ROMANELLO, KAREN S.; TEIXEIRA, KARINA K. L.; SILVA, JOAO PEDRO M. O.; NAGAMATSU, SHEILA T.; BEZERRA, MARCOS ANDRE C.; DOMINGOS, IGOR F.; MARTINE, DIEGO A. P.; ARAUJO, ADERSON S.; LANARO, CAROLINA; BREYER, CARLOS A.; FERREIRA, REGIANE A.; FRANCO-PENTEADO, CARLA; COSTA, FERNANDO F.; MALAVAZI, IRAN; NETTO, LUIS E. S.; DE OLIVEIRA, MARCOS A.; CUNHA, ANDERSON F. Global analysis of erythroid cells redox status reveals the involvement of Prdx1 and Prdx2 in the severity of beta thalassemia. PLoS One, v. 13, n. 12 DEC 6 2018. Citações Web of Science: 0.

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