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Investigação do envolvimento da Thr44 de Tsa1 de Saccharomyces Cerevisiae na reatividade sobre hidroperóxidos e interação com Trx

Processo: 11/21365-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2012
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Rafael Henrique Bagini
Instituição-sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:07/50930-3 - Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: uma investigação de mecanismos moleculares de catálise e da formação de complexos protéicos contendo dissulfetos mistos, AP.JP
Assunto(s):Tiorredoxinas   Saccharomyces cerevisiae   Peroxirredoxinas

Resumo

As Peroxirredoxinas (Prx) da classe 2-Cys são proteínas antioxidantes capazes de decompor hidroperóxidos utilizando um resíduo de Cys altamente reativo presente em seus sítios ativos, denominado cisteína peroxidásica (CysP), que ao reduzir o hidroperóxido forma uma interação dissulfeto com um segundo resíduo de Cys, denominada cisteína de resolução (CysR). A CysP está cercada por três resíduos altamente conservados entre as Prx, que são uma Pro, uma Thr/Ser e uma Arg, denominados tríade catalítica. Esses resíduos interagem com a CysP, fazendo com que esta fique na forma de tiolato (CysP-S-) a fim de reduzir seu pKa aumentando assim sua reatividade. Diversos trabalhos apontam que, adicionalmente ao seu papel na desprotonação da CysP o resíduo conservado de treonina/serina também estaria envolvido no reconhecimento e especificidade do substrato. Durante a reação de oxidorredução, as Prx 2-Cys necessitam efetuar uma mudança estrutural da ±-hélice onde se encontra a CysP, alternando entre duas conformações: fully folded (FF), quando as Cys da proteína estão reduzidas e a ±-hélice na qual está localizada a CysP se encontra totalmente enovelada, e locally unfolded (LU), observada após a reação com o hidroperóxido, que causa o desenovelamento parcial da ±-hélice culminando na formação de uma ponte dissulfeto entre as cisteínas. Após a redução de hidroperóxidos, as cisteínas oxidadas das Prx são reduzidas pela proteína tiorredoxina (Trx), podendo reagir com uma nova molécula de hidroperóxido. Em Saccharomyces cerevisiae, há duas isoformas citosólicas de Prx denominadas de Tsa1 e Tsa2, que possuem grande semelhança (86% de identidade e 96% de similaridade). Entretanto, existem diferenças significativas no pKa da CysP (Tsa1= 5,4 e Tsa2= 6,3), o que indica uma reatividade 10´ maior de Tsa1 sobre hidroperóxidos em pH fisiológico. Recentemente foi determinada a estrutura da Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae, e análise de sua estrutura cristalográfica revela que a única diferença no sitio ativo destas enzimas reside em um resíduo de Thr(44) em Tsa1 que é substituído por uma Ser em Tsa2, o que indica que este resíduo possa estar implicado no pKa da CysP. Análises adicionais da estrutura quaternária de Tsa1 revelam que um segundo resíduo de Arg (146) está envolvida no posicionamento espacial de CysP, por meio de uma rede interações moleculares polares com Glu50 e Arg123, os quais possuem implicações no enovelamento e reatividade de CysP. Neste contexto, o resíduo de Thr44 se encontra em grande proximidade com a CysP do lado oposto dessa rede, podendo também estar envolvida nas transições dos estados FF/LU. Análises da superfície molecular da Prx2-Cys típica de Rattus novergicus em dissulfeto (LU) revelam franca proximidade da Thr com o dissulfeto e indicam sua necessidade para interações com o substrato redutor (Trx),. Este projeto tem como objetivos investigações do envolvimento da Thr44 na transição dos estados FF e LU, suas contribuições na redução do pKa e reatividade de CysP de Tsa1 e importância na redução das 2-Cys Prx por Trx. Para tanto, é proposto a obtenção de mutantes Tsa1T44A, Tsa1T44S e Tsa1T44V, suas expressões e purificações bem como a caracterização funcional destes mutantes por meio de ensaios bioquímicos de oxidação do DTT, atividade peroxidásica dependente do sistema Trx de levedura, cinética competitiva com HRP (Horseradish peroxidase) e determinação do pKa da CysP. Também serão avaliadas possíveis alterações da estrutura quaternária das proteínas mutantes por meio de cromatografia de exclusão molecular (SEC). Este projeto já conta com resultados preliminares e até o presente momento já foram obtidos os mutantes Tsa1T44A e Tsa1T44V e a padronização de suas expressões está sendo efetuada. Acreditamos que os resultados obtidos neste projeto poderão fornecer importantes contribuições para uma maior compreensão dos mecanismos que envolvem a alta eficiência catalítica, e o reconhecimento e especificidade por substratos das Prx