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Relação estrutura-função de uma beta-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida

Processo: 11/22966-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de março de 2012
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2017
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Pesquisador responsável:Rosa dos Prazeres Melo Furriel
Beneficiário:Luana Parras Meleiro Garcia
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Enzimas   Pichia pastoris   beta-Glucosidase   Glicose   Xilose   Fungos termófilos   Escherichia coli   Glicosilação   Sacarificação

Resumo

A celulose é um dos componentes majoritários dos subprodutos agroindustriais e constitui a fonte de carbono renovável mais abundante do planeta. Atualmente a sacarificação enzimática da celulose é alvo de grande interesse e pode gerar benefícios ambientais e econômicos incontestáveis, em particular pela produção viável de etanol de segunda geração. A hidrólise enzimática da celulose envolve a ação sinérgica de endo-1,4-ß-glucanases, exo-1,4-ß-glucanases e 1,4-ß-glucosidases. As duas primeiras enzimas atuam sobre as fibras da celulose, produzindo oligossacarídeos e celobiose, os quais serão clivados a glicose pela ß-glucosidase. Considerando que endo- e exo-glucanases são geralmente inibidas por celobiose e celo-oligossacarídeos curtos, as beta-glucosidases são responsáveis pelo passo limitante do processo. Entretanto, a maioria das ß-glucosidases conhecidas também é inibida por glicose, gerando grande interesse por enzimas tolerantes à glicose. Recentemente foi purificada e caracterizada em nosso laboratório uma ²-glucosidase do fungo termófilo Humicola insolens ativada por glicose ou xilose em concentrações de até 400 mmol.L-1. Esta propriedade rara, sua boa termoestabilidade e alta eficiência catalítica para a hidrólise de celobiose sugerem uma aplicação interessante na sacarificação de materiais lignocelulósicos. Entretanto, esta enzima é intracelular e produzida em baixos níveis, dificultando sua aplicação em larga escala. Assim, o seu gene foi clonado e sequenciado, e a enzima expressa em Escherichia coli na forma ativa e solúvel, com alto rendimento. A enzima heteróloga purificada apresentou maior eficiência catalítica para a hidrólise de celobiose que a forma nativa, mantendo a estimulação por glicose e xilose. Desta forma, apresenta extraordinário potencial para viabilizar economicamente a sacarificação enzimática da celulose. O objetivo principal deste projeto é o estudo da relação estrutura-função da ß-glucosidase estimulada por glicose e xilose de H. insolens por meio de técnicas de evolução dirigida. Os resultados pretendidos poderão levar à identificação dos determinantes estruturais da estimulação pelos monossacarídeos, contribuindo ainda para esclarecer o intrigante mecanismo de estimulação da enzima pelo produto da reação. A partir da identificação das sequências de bases que codificam para as regiões da enzima envolvidas na estimulação por glicose/xilose, poderão também ser identificadas e/ou desenvolvidas ß-glucosidases com propriedades análogas, de interesse biotecnológico. Além disso, serão feitos esforços no sentido de expressar a enzima de H. insolens em Pichia pastoris, a fim de estudar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas, biofísicas e estruturais da enzima, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em E. coli e P. pastoris. (AU)