Relação estrutura-função de uma beta-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida

• Processo: 11/22966-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2012
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2017
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Rosa dos Prazeres Melo Furriel
• Beneficiário: Luana Parras Meleiro Garcia
• Instituição Sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Enzimas Pichia pastoris beta-Glucosidase Glicose Xilose Fungos termófilos Escherichia coli Glicosilação Sacarificação
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: beta-glucosidase estimulada por glicose e xilose | Evolução dirigida | glicosilação | Humicola insolens | Relação Estrutura-Função | sacarificação da celulose | Enzimas de interesse biotecnológico

Resumo

A celulose é um dos componentes majoritários dos subprodutos agroindustriais e constitui a fonte de carbono renovável mais abundante do planeta. Atualmente a sacarificação enzimática da celulose é alvo de grande interesse e pode gerar benefícios ambientais e econômicos incontestáveis, em particular pela produção viável de etanol de segunda geração. A hidrólise enzimática da celulose envolve a ação sinérgica de endo-1,4-ß-glucanases, exo-1,4-ß-glucanases e 1,4-ß-glucosidases. As duas primeiras enzimas atuam sobre as fibras da celulose, produzindo oligossacarídeos e celobiose, os quais serão clivados a glicose pela ß-glucosidase. Considerando que endo- e exo-glucanases são geralmente inibidas por celobiose e celo-oligossacarídeos curtos, as beta-glucosidases são responsáveis pelo passo limitante do processo. Entretanto, a maioria das ß-glucosidases conhecidas também é inibida por glicose, gerando grande interesse por enzimas tolerantes à glicose. Recentemente foi purificada e caracterizada em nosso laboratório uma ²-glucosidase do fungo termófilo Humicola insolens ativada por glicose ou xilose em concentrações de até 400 mmol.L-1. Esta propriedade rara, sua boa termoestabilidade e alta eficiência catalítica para a hidrólise de celobiose sugerem uma aplicação interessante na sacarificação de materiais lignocelulósicos. Entretanto, esta enzima é intracelular e produzida em baixos níveis, dificultando sua aplicação em larga escala. Assim, o seu gene foi clonado e sequenciado, e a enzima expressa em Escherichia coli na forma ativa e solúvel, com alto rendimento. A enzima heteróloga purificada apresentou maior eficiência catalítica para a hidrólise de celobiose que a forma nativa, mantendo a estimulação por glicose e xilose. Desta forma, apresenta extraordinário potencial para viabilizar economicamente a sacarificação enzimática da celulose. O objetivo principal deste projeto é o estudo da relação estrutura-função da ß-glucosidase estimulada por glicose e xilose de H. insolens por meio de técnicas de evolução dirigida. Os resultados pretendidos poderão levar à identificação dos determinantes estruturais da estimulação pelos monossacarídeos, contribuindo ainda para esclarecer o intrigante mecanismo de estimulação da enzima pelo produto da reação. A partir da identificação das sequências de bases que codificam para as regiões da enzima envolvidas na estimulação por glicose/xilose, poderão também ser identificadas e/ou desenvolvidas ß-glucosidases com propriedades análogas, de interesse biotecnológico. Além disso, serão feitos esforços no sentido de expressar a enzima de H. insolens em Pichia pastoris, a fim de estudar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas, biofísicas e estruturais da enzima, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em E. coli e P. pastoris. (AU)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

GARCIA, Luana Parras Meleiro. Relação estrutura-função de uma -glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida. 2017. Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC) Ribeirão Preto.