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Biologia química: novos alvos moleculares naturais e sintéticos contra o câncer: estudos estruturais, avaliação biológica e modos de ação

Processo: 12/02222-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de março de 2012
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Orgânica
Convênio/Acordo: NSF - Universidades Americanas (Química)
Pesquisador responsável:Ronaldo Aloise Pilli
Beneficiário:Mariana Pereira Dias
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:09/51602-5 - Biologia química: novos alvos moleculares naturais e sintéticos contra o câncer, estudos estruturais, avaliação biológica e modo de ação, AP.TEM
Assunto(s):Difração por raios X   Neoplasias   Síntese orgânica   Monoester fosfórico hidrolases

Resumo

As proteínas humanas serão produzidas em sistema recombinante, utilizando protocolos já estabelecidos. O produto proteico resultante conterá uma cauda de 6xHis na porção N-terminal das proteínas produzidas, facilitando sua purificação por cromatografia de afinidade, utilizando-se uma resina de Níquel (Ni Sepharose 6 Fast Flow, GE Life Sciences). A cauda de histidina será clivada utilizando-se a enzima trombina bovina (Sigma) e em seguida a amostra será submetida a cromatografia de exclusão molecular. As etapas de expressão e purificação das proteínas de interesse serão acompanhadas por análises de migração da proteína em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (PAGE/SDS) [1]. Os ensaios de atividade enzimática serão realizados por um método colorimétrico bem estabelecido, utilizando pNPP (para nitro fenol fosfato) como substrato [2]. As enzimas purificadas serão submetidas a ensaios de atividade enzimática na presença de compostos orgânicos oriundos do Projeto Temático vinculado, utilizando-se protocolo de triagem já estabelecido. Nestes ensaios será utilizado o substrato pNPP, onde a produção do produto pNP é acompanhada através de medidas de absorbância a 405 nm, a qual será monitorada em leitor de placa M2e (Molecular Devices). Um grupo de controle positivo, correspondendo à atividade enzimática na ausência de inibidor, será sempre introduzido para posterior cálculo da porcentagem de inibição proporcionada para cada composto testado como inibidor. Nos ensaios de triagem inicial será utilizada uma concentração única dos inibidores (100 micromol/l). Os inibidores identificados serão submetidos a novos ensaios de atividade, agora na presença da enzima catalase, para evitar a identificação de inibidores que agem por mecanismo redox [5]. Inibidores que apresentarem mecanismo direto de inibição da enzima serão submetidos a novos experimentos de cinética enzimática, onde serão variadas as concentrações de inibidor e de substrato para a determinação do mecanismo de inibição, do valor de IC50 e da constante de inibição (Ki). Posteriormente, os inibidores identificados serão submetidos a ensaios de cristalização para determinação dos complexos cristalográficos fosfatase:inibidor. Serão utilizadas duas metodologias para obtenção dos complexos cristalográficos: co-cristalização e soaking. Os ensaios de cristalização serão conduzidos utilizando-se o método de gota suspensa (LMW-PTP) ou método da gota sentada (CDC25B e PTP1B), com uma solução da proteína em concentração entre 5 e 10 mg/ml. Protocolos de cristalização das fosfatases selecionadas em forma apo já foram implementados no Laboratório de Biologia Estrutural e Cristalografia. Testes de co-cristalização e soaking foram realizados com alguns ininidores identificados, encontrando-se em fase final de implementação. Para co-cristalização o inibidor será incubado com a proteína por um período de pelo menos 1 hora, empregando-se razão molar proteína:inibidor de 1:2 a 1:5. Posteriormente as gotas de cristalização serão montadas, utilizando-se a condição de cristalização da proteína apo já determinada e testando-se algumas variações desta para garantir a formação do co-cristal. No soaking o cristal da proteína apo será transferido para uma nova gota de cristalização contendo o inibidor em concentração em torno de 1 mmol/l. (AU)