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Plataforma para geração de uma linhagem celular humana com elevado número de cópias do cDNA relativo ao fator VIIIDB selvagem e sintético da coagulação sanguínea

Processo: 12/00839-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2012
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Aparecida Maria Fontes
Beneficiário:Angelo Luis Caron
Instituição-sede: Hemocentro de Ribeirão Preto. Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP (HCMRP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Fator VIII   Hemofilia A   Lentivirus   Terapia genética   Biologia sintética   Coagulação sanguínea

Resumo

A hemofilia A é uma doença genética ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). Sua maior incidência é em homens, ocorrendo em 1:5.000 nascimentos, e é caracterizada por hemorragias causadas por traumas ou mesmo espontâneas. Os tratamentos atuais consistem na terapia de reposição com fator VIII derivado do plasma (pdFVIII) ou fator VIII recombinante (FVIIIr). Apesar das vantagens do FVIIIr quando comparado ao pdFVIII, como a impossibilidade de transmissão de doenças virais, o recombinante é caro devido a sua limitada disponibilidade e pouca concorrência de mercado. Além disso, o FVIIIr disponível é derivado de células murinas, apresentando um perfil diferente de glicosilação, o que pode resultar na produção de inibidores quando infundido nos pacientes. Dessa forma, é essencial o desenvolvimento de novas plataformas que reduzam a produção de inibidores e possibilitam altos níveis de expressão da proteína, o que sugere a utilização de células humanas como produtoras do FVIIIr e de um sistema eficiente e seguro de integração do cDNA do FVIIIr no genoma das células. Recentemente, diversos estudos têm mostrado a eficiência do sistema lentiviral em ensaios clínicos. Além disso, o lentivirus permite a múltiplas integrações do cDNA no genoma das células em regiões de transcrição ativas. Assim, a hipótese desse trabalho é que a Biologia Sintética pode fornecer novas moléculas do FVIII da coagulação, com os quais é possível a geração de uma linhagem celular humana portadora de múltiplas cópias do cDNA relativo ao FVIIIDB selvagem produtora de altos níveis da proteína do FVIIIr. Para isso, as células serão submetidas a múltiplos ciclos de transdução com um vetor lentiviral de terceira geração portador do cDNA do FVIIIDB e do gene de resistência neomicina. As células tranduzidas serão selecionadas por meio de tratamento com o antibiótico geneticina. E os níveis de expressão do RNAm e da proteína biologicamente ativa do FVIII serão avaliadas no primeiro, quinto e décimo ciclo de transdução.