Investigação de estados oligoméricos, reatividade sobre hidroperóxidos e relações REDOX de Ahp1 de Saccharomyces cerevisiae.

• Processo: 11/23191-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Vigência (Início): 01 de janeiro de 2012
• Vigência (Término): 30 de novembro de 2013
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Marcos Antonio de Oliveira
• Beneficiário: Leonardo Schultz da Silva
• Instituição Sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 07/50930-3 - Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: uma investigação de mecanismos moleculares de catálise e da formação de complexos protéicos contendo dissulfetos mistos, AP.JP
• Assunto(s): Tiorredoxinas Estrutura Saccharomyces cerevisiae Peroxirredoxinas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Ahp1 | Complexo | Estrutura | peroxirredoxinas | Saccharomyces cerevisiae | Tiorredoxinas | Estrutural

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) são proteínas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de peróxidos utilizando cisteínas altamente reativas para efetuar as reduções. Grande parcela das Prx encontra-se na forma de dímero obrigatório e após a redução dos peróxidos, as cisteínas da Prx formam um dissulfeto entre os dois monômeros (intermolecular), o qual necessita ser reduzido para que a proteína possa realizar uma nova catálise. A grande maioria das Prx tem suas cisteínas reduzidas pelas Tiorredoxinas (Trx), que efetuam a transferência de equivalentes redutores por meio de pares de cisteínas presentes em seus sítios ativos. Já foi demonstrado que no processo de transferência de elétrons entre Trx-Prx, ocorre a formação de um dissulfeto intermolecular transiente, dessa forma, a substituição de um resíduo de cisteína por uma serina poderia acarretar na formação de um complexo unido por dissulfetos moleculares estáveis entre a Prx e Trx. A levedura Saccharomyces cerevisiae possui cinco isoformas de Prx sendo que três são encontradas no citoplasma (Tsa1, Tsa2 e Ahp1), uma na mitocôndria (mTpx) e uma no núcleo (Dot5). Dentre as isoformas citosólicas, Tsa1 e Tsa2 apresentam constantes de segunda ordem para o H2O2 extremamente elevadas (2´107 M-1s-1), compartilham grande similaridade na sua estrutura primária (86% de identidade e 96% de similaridade) e, adicionalmente a função peroxidásica, em determinadas condições, estas enzimas podem se associar formando estruturas decaméricas (a2[5]), ou estruturas de maior massa molecular, que possuem atividade de chaperona molecular, em um processo dependente de Trx. Ahp1 por sua vez possui baixa relação na sequencia de aminoácidos (~28% de identidade e 47% de similaridade) com Tsa1 e Tsa2 e não apresenta atividade de chaperona molecular. Entretanto, apesar de uns poucos estudos terem indicado que Ahp1 possui afinidade por peróxidos orgânicos 20 ´ que Tsa1 ou Tsa2, Ahp1 é a menos compreendida das Prx citosólicas de levedura, constantes de segunda ordem para H2O2 ou peróxidos orgânicos ainda não foram determinadas e dados sobre seu estado oligomérico são controversos. Apesar das diferenças entre Ahp1 e Tsa1/Tsa2, todas são eficientemente reduzidas pela tiorredoxina citosólica 1 de levedura (Trx1), uma enzima de grande relevância biológica, que adicionalmente a redução das Prx citosólicas, está envolvida em diversos outros processos biológicos como crescimento celular, inibição de apoptose, ativação de transcrição e síntese de DNA. Entretanto, a transferência de equivalentes redutores com seus substratos ainda é mal compreendida. Em projetos anteriores desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa, foram construídos mutantes e desenvolvidas metodologias que tornou possível a obtenção de complexos proteicos Ahp1-Trx1C33S unidos por dissulfetos mistos, que foram validados através de espectrometria de massas. Este projeto tem por objetivo identificar e confirmar em qual cisteína de Ahp1 se forma dissulfeto misto com Trx1, utilizando espectrometria de massas, investigar o grau oligomérico de Ahp1 nos estados reduzido, oxidada em dissulfeto, superoxidada e quando em complexo com Trx1 através de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS), por fim, determinar as constantes de segunda ordem, para H2O2 e peróxidos orgânicos, de Ahp1 através de cinética competitiva com HRP e experimentos envolvendo alterações da fluorescência intrínseca de resíduos de triptofano relacionados com alterações estruturais durante o ciclo de oxirredução.