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Investigação de estados oligoméricos, reatividade sobre hidroperóxidos e relações redox de AHP1 de Saccharomyces Cerevisiae

Processo: 11/23191-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2012
Vigência (Término): 30 de novembro de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Leonardo Schultz da Silva
Instituição-sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:07/50930-3 - Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: uma investigação de mecanismos moleculares de catálise e da formação de complexos protéicos contendo dissulfetos mistos, AP.JP
Assunto(s):Tiorredoxinas   Estrutura   Saccharomyces cerevisiae   Peroxirredoxinas

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) são proteínas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de peróxidos utilizando cisteínas altamente reativas para efetuar as reduções. Grande parcela das Prx encontra-se na forma de dímero obrigatório e após a redução dos peróxidos, as cisteínas da Prx formam um dissulfeto entre os dois monômeros (intermolecular), o qual necessita ser reduzido para que a proteína possa realizar uma nova catálise. A grande maioria das Prx tem suas cisteínas reduzidas pelas Tiorredoxinas (Trx), que efetuam a transferência de equivalentes redutores por meio de pares de cisteínas presentes em seus sítios ativos. Já foi demonstrado que no processo de transferência de elétrons entre Trx-Prx, ocorre a formação de um dissulfeto intermolecular transiente, dessa forma, a substituição de um resíduo de cisteína por uma serina poderia acarretar na formação de um complexo unido por dissulfetos moleculares estáveis entre a Prx e Trx. A levedura Saccharomyces cerevisiae possui cinco isoformas de Prx sendo que três são encontradas no citoplasma (Tsa1, Tsa2 e Ahp1), uma na mitocôndria (mTpx) e uma no núcleo (Dot5). Dentre as isoformas citosólicas, Tsa1 e Tsa2 apresentam constantes de segunda ordem para o H2O2 extremamente elevadas (2´107 M-1s-1), compartilham grande similaridade na sua estrutura primária (86% de identidade e 96% de similaridade) e, adicionalmente a função peroxidásica, em determinadas condições, estas enzimas podem se associar formando estruturas decaméricas (a2[5]), ou estruturas de maior massa molecular, que possuem atividade de chaperona molecular, em um processo dependente de Trx. Ahp1 por sua vez possui baixa relação na sequencia de aminoácidos (~28% de identidade e 47% de similaridade) com Tsa1 e Tsa2 e não apresenta atividade de chaperona molecular. Entretanto, apesar de uns poucos estudos terem indicado que Ahp1 possui afinidade por peróxidos orgânicos 20 ´ que Tsa1 ou Tsa2, Ahp1 é a menos compreendida das Prx citosólicas de levedura, constantes de segunda ordem para H2O2 ou peróxidos orgânicos ainda não foram determinadas e dados sobre seu estado oligomérico são controversos. Apesar das diferenças entre Ahp1 e Tsa1/Tsa2, todas são eficientemente reduzidas pela tiorredoxina citosólica 1 de levedura (Trx1), uma enzima de grande relevância biológica, que adicionalmente a redução das Prx citosólicas, está envolvida em diversos outros processos biológicos como crescimento celular, inibição de apoptose, ativação de transcrição e síntese de DNA. Entretanto, a transferência de equivalentes redutores com seus substratos ainda é mal compreendida. Em projetos anteriores desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa, foram construídos mutantes e desenvolvidas metodologias que tornou possível a obtenção de complexos proteicos Ahp1-Trx1C33S unidos por dissulfetos mistos, que foram validados através de espectrometria de massas. Este projeto tem por objetivo identificar e confirmar em qual cisteína de Ahp1 se forma dissulfeto misto com Trx1, utilizando espectrometria de massas, investigar o grau oligomérico de Ahp1 nos estados reduzido, oxidada em dissulfeto, superoxidada e quando em complexo com Trx1 através de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS), por fim, determinar as constantes de segunda ordem, para H2O2 e peróxidos orgânicos, de Ahp1 através de cinética competitiva com HRP e experimentos envolvendo alterações da fluorescência intrínseca de resíduos de triptofano relacionados com alterações estruturais durante o ciclo de oxirredução.

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