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Caracterização cinética da redução de 1-Cys peroxirredoxinas por ascorbato

Processo: 12/00629-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de abril de 2012
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2017
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
Pesquisador responsável:Luis Eduardo Soares Netto
Beneficiário:Valesca Anschau
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Peroxidase   Estresse oxidativo

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) são enzimas ubíquas capazes de degradar peróxidos orgânicos, peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. São classificadas em 1-Cys ou 2-Cys Prxs, dependendo do número de cisteínas envolvidas em seu ciclo catalítico. No caso da maioria das 1-Cys Prxs, a identidade do redutor biológico é ainda controversa. Nosso grupo apresentou evidências de que ascorbato poderia sustentar a atividade peroxidásica de 1-Cys Peroxirredoxinas (Monteiro c col., 2007). No presente projeto de pesquisa, pretendemos obter mais evidências de que essa via pode realmente ser relevante em sistemas biológicos. Nesse sentido, duas estratégias serão realizadas: (1) determinação de parâmetros enzimáticos relacionados a redução de 1-Cys Prx por ascorbato; e (2) investigação da resposta de células pulmonares a estresse oxidativo em condições nas quais 1-Cys Prx e/ou ascorbato são inibidos. Em relação à primeira estratégia, algumas modelagens in silico e mutações sítio dirigidas já foram realizadas em nosso laboratório (usando Prdx6 de Rattus norvegicus como modelo de 1-Cys Prx) e indicaram o envolvimento de alguns aminoácidos na redução de 1-Cys por ascorbato. Todavia, para avançarmos na compreensão da relevância biológica desse processo é imprescindível quantificarmos a redução de 1-Cys Prx por ascorbato. Para atingir essa meta, faremos ensaios enzimáticos usando eletrodos para peróxido de hidrogênio (Free Radical Analyzer 4100 da World Precision Instruments) e uso de peroxixantona, uma sonda fluorescente a base de boro que ao reagir com peróxido de hidrogênio gera um produto fluorescente. Resultados preliminares indicam que as duas metodologias não sofrem interferência de ascorbato. Em relação a estratégia (2), pretendemos silenciar os níveis de 1-Cys Prx (Prdx6 em mamíferos) usando procedimento já estabelecido na literatura. Os níveis de ascorbato serão modulados de acordo com a adição dessa vitamina no meio de cultura de células de humanos. Esse controle dos níveis de ascorbato será possível, pois seres humanos são incapazes de sintetizar ascorbato. Dessa forma, inibindo simultaneamente ou isoladamente os níveis de ascorbato e 1-Cys Prx poderemos analisar comparativamente a resposta da célula de pulmão de humanos a estresse oxidativo induzido por peróxido.

Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
ANSCHAU, Valesca. Caracaterização cinética da redução das 1-Cys Peroxirredoxinas por ascorbato. 2017. Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Biociências São Paulo.

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