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Detecção de mutações em Mycobacterium tuberculosis resistentes a rifampicina pela PCR: quantitativo em tempo real seguida de curva de dissociação de DNA de alta resolução utilizando um único plasmídeo recombinante como controle positivo

Processo: 12/17994-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de outubro de 2012
Vigência (Término): 31 de março de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
Pesquisador responsável:Mario Hiroyuki Hirata
Beneficiário:Camila Rodrigues Gomez
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Mycobacterium tuberculosis   Mutação

Resumo

O gene RpoB, codificador da subunidade beta da RNA polimerase do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e alvo da rifampicina, tem sido utilizado como marcador de multirresistência. Mutações neste gene, associadas à resistência a rifampicina, tem boa relação com resistência a outros fármacos utilizados no tratamento contra o Mtb. A utilização de técnicas que facilitam a identificação destas mutações reduz o período de tempo necessário para a remissão da doença em indivíduos infectados com Mtb multirresistente, bloqueia a transmissão de bacilos e diminui o custo do tratamento. A PCR em tempo real com curva de dissociação de alta resolução (qPCR-HRM) tem sido bastante utilizada para detecção de mutações. Este ensaio consiste na amplificação de DNA em presença de corante fluorescente seguido pela dissociação do DNA, a qual é medida com o aumento da temperatura e consequente redução da fluorescência. Alteração de uma única base nitrogenada pode ser identificada comparando-se o perfil de dissociação da amostra com controles positivo e negativo. Em estudo prévio, um fragmento de 158 pb contendo a região RRDR (Rifampicin Resistance Determining Region) do gene RpoB, foi amplificado, clonado no pGEM-T e utilizado como controle para detecção de mutações em 54 isolados clínicos. Os resultados apresentaram uma alta especificidade e sensibilidade, quando comparados com sequenciamento de DNA. O objetivo do presente trabalho é facilitar a detecção de mutações no gene RpoB utilizando, em um único tubo de PCR, amostra de DNA de Mtb a ser analisada e plasmídeo controle contendo as principais mutações do gene rpoB na RRDR. A ausência de hibridização entre regiões de DNA não complementares, devido à presença de mutação, influenciará significativamente na curva de dissociação de alta resolução, auxiliando na identificação de mutações específicas pelo próprio operador do equipamento. Um total de 100 cepas serão analisadas pela qPCR-HRM e os resultados comparados com o sequenciamento de DNA. Adicionalmente, a detecção de resistência micobacteriana as drogas poderá ser acoplada a detecção de micobactérias. Assim, será possível identificar o microrganismo juntamente com o perfil de sensibilidade as droga. (AU)