Análise de alterações na expressão gênica e na atividade enzimática resultantes de variações intrônicas e exônicas no gene CYP21A2

• Processo: 12/16815-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Vigência (Início): 01 de outubro de 2012
• Vigência (Término): 29 de fevereiro de 2016
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Maricilda Palandi de Mello
• Beneficiário: Débora de Paula Michelatto
• Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Bolsa(s) vinculada(s): 14/09844-0 - Análise funcional de novas variações nucleotídicas no gene CYP21A2 identificadas em pacientes com hiperplasia da adrenal congênita, BE.EP.DD
• Assunto(s): Análise para determinação do sexo Desenvolvimento sexual Expressão gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: atividade enzimática | Cyp21A2 | expressão gênica | Mutações | Endocrinologia Pediátrica

Resumo

A definição do sexo ao nascimento ou, até mesmo antes deste, tem sido essencial para a sociedade em que vivemos hoje. Quando não é possível, é motivo de aflição para a família e, mais tarde, para a criança. O desenvolvimento do sexo fetal pode ser dividido em três etapas: o estágio indiferenciado, a diferenciação gonadal e a diferenciação da genitália interna e externa, sendo esta última etapa dependente da ação de hormônios. Defeitos em qualquer um desses estágios podem resultar em distúrbios do desenvolvimento sexual. Dentre inúmeras possibilidades para que isto ocorra está a Hiperplasia da Adrenal Congênita cuja manifestação se reflete no desenvolvimento da genitália externa. A HAC é uma das doenças autossômicas recessivas mais frequentes, podendo ser causada pela deficiência de uma das cinco enzimas que catalisam os vários passos da síntese de esteroides adrenais. Participam da síntese de esteroides adrenais as enzimas P450scc-StaR, 3²-hidroxiesteróide desidrogenase, 21-hidroxilase, 11²-hidroxilase e 17±-hidroxilase e, dentre as principais formas de HAC, se destaca a deficiência da 21-hidroxilase (gene CYP21A2) que ocorre em mais de 95% dos casos. Nos tempos em que o sequenciamento de DNA não era acessível, primeiramente buscava-se definir nos alelos afetados a presença ou ausência de deleção, conversão gênica e 9 mutações pontuais derivadas do pseudogene CYP21A1P (microconversões), eventos mutacionais bastante frequentes para esse gene. Para isso eram usadas as técnicas de Southern blot e ASO-PCR. Caso o genótipo não ficasse esclarecido, o gene era sequenciado em busca de novas mutações ou mutações não provenientes do pseudogene. Atualmente, faz-se diretamente o sequenciamento do gene para se definir haplótipos, uma vez que há variações de um único nucleotídeo (SNV, single nucleotide variation) que podem atuar sinergicamente para agravar o efeito de mutações ou conferir diferenças importantes no fenótipo dos indivíduos afetados. No caso de excesso de homozigose ou cuja segregação alélica não se esclareça com o sequenciamento, a variação no número de cópias (CNV) pode ser confirmada por MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Para as SNVs que ainda não foram anotadas e que porventura sejam identificadas em éxons e íntrons, há necessidade de comprovação do efeito biológico para a sua descrição e para o estabelecimento de uma correlação fenótipo-genótipo adequada. Dando continuidade ao estudo de nosso grupo de pesquisa, propomos avaliar quanto ao efeito funcional as alterações exônicas e intrônicas que sejam novas ou pouco frequentes, identificadas no gene CYP21A2 em famílias com indivíduos afetados pela HAC por deficiência de 21-hidroxilase, dando ênfase às formas tardias da deficiência. Para este estudo, esta proposta tem por objetivo clonar e expressar os genes CYP21A2 portadores das SNVs quando se tratarem de alterações que levam à troca de aminoácidos e nos casos de alterações intrônicas será utilizada a técnica de mini-genes. O estudo incluirá as seguintes alterações: 1) as que envolvem troca pontual de aminoácidos p.L12M, p.S202G, p.D377Y, p.L461P e p.T450M; 2) a mutação in frame c.1170_1178delAGGCGCCCA ou p.(Gln389_Ala381del); 3) as combinações de mutações p.30L+p.P453S, p.V281L+p.R483Q e p.D377Y+p.L461P; 4) as alterações novas em regiões não codificantes c.-465G>C; c.-118T>C, c.289+37T>A (IVS2+37T>A), c.936+5G>A (IVS7+5G>A) e a 3'UTR+56C>G; e, 5) as raras c.290-74A>G (IVS2-74A>G), c.936+11G>C (IVS7+11G>C) e c.1222+25G>A (IVS9+25G>A). Todas foram previamente identificadas no gene CYP21A2 em pacientes com a deficiência de 21-hidroxilase tanto na forma clássica como na não-clássica. Trata-se de um trabalho de grande importância e relevância para o diagnóstico molecular das deficiências aqui incluídas no sentido de proporcionar não só o diagnóstico molecular, mas também oferecer de forma mais acurada o aconselhamento genético e os diagnósticos neo- e pré-natal para as famílias envolvidas. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

DA SILVA-GRECCO, ROSEANE LOPES; MICHELATTO, DEBORA DE PAULA; LINCOLN-DE-CARVALHO, CAROLINA RODRIGUES; HENRIQUE, PAMELA PONTES; DA CUNHA, HELOISA MARCELINA; PALANDI-DE-MELLO, MARICILDA. A de novo mutation in CYP21A2 gene in a case of in vitro fertilization. MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM REPORTS, v. 5, p. 98-102, DEC 2015. (12/16815-0)

MICHELATTO, DEBORA DE PAULA; KARLSSON, LEIF; GORI LUSA, ANA LETICIA; MGNANI SILVA, CAMILA D'ALMEIDA; OSTBERG, LINUS JOAKIM; PERSSON, BENGT; GUERRA-JUNIOR, GIL; VALENTE DE LEMOS-MARINI, SOFIA HELENA; BARBARO, MICHELA; DE MELLO, MARICILDA PALANDI; et al. Functional and Structural Consequences of Nine CYP21A2 Mutations Ranging from Very Mild to Severe Effects. INTERNATIONAL JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY, 2016. (11/51808-2, 14/09844-0, 12/16815-0)

KARLSSON, LEIF; MICHELATTO, DEBORA DE PAULA; GORI LUSA, ANA LETICIA; MGNANI SILVA, CAMILA D'ALMEIDA; OSTBERG, LINUS J.; PERSSON, BENGT; GUERRA-JUNIOR, GIL; VALENTE DE LEMOS-MARINI, SOFIA HELENA; BALDAZZI, LILIA; MENABO, SOARA; et al. Novel non-classic CYP21A2 variants, including combined alleles, identified in patients with congenital adrenal hyperplasia. CLINICAL BIOCHEMISTRY, v. 73, p. 50-56, NOV 2019. (14/09844-0, 11/51808-2, 12/16815-0)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

MICHELATTO, Débora de Paula. Functional importance of novel nucleotide variations in the CYP21A2 gene. 2016. Tese de Doutorado - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia Campinas, SP.