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Mutações sítio dirigidas na metaloenzima Cu,Zn-superóxido dismutase (SOD1): efeitos estruturais e funcionais na enzima

Processo: 12/24604-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de abril de 2013
Vigência (Término): 31 de março de 2017
Área do conhecimento:Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Inorgânica
Pesquisador responsável:Giselle Cerchiaro
Beneficiário:Tânia Maria Manieri
Instituição-sede: Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH). Universidade Federal do ABC (UFABC). Ministério da Educação (Brasil). Santo André , SP, Brasil
Assunto(s):Superóxido dismutase   Cobre   Mutação

Resumo

Entender os mecanismos pelos quais os radicais livres e espécies oxidantes atuam em processos fisiológicos torna-se cada vez mais complexo, especialmente aqueles envolvendo metais de transição com elevada atividade redox como o cobre, ou participante de muitas funções celulares como o zinco, ambos presentes na metaloenzima Cu,Zn-Superóxido Dismutase (SOD1), sendo que muitos processos envolvendo a sua agregação e função peroxidásica deletéria ainda está em plena discussão na literatura, após mais de 40 anos de sua descoberta e caracterização. Nesta área de pesquisa o papel de mutações na enzima relacionado a casos familiares da doença Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) começa ser elucidado recentemente, onde soube-se que o tipo de agregação proteica observado e a gravidade da doença apresenta relação com o tipo de mutação na SOD1. Mutações que afetam o modo de coordenação do zinco são as mais intrigantes, pois revelam uma alta patogenicidade da ELA. Sabe-se muito pouco sobre como a SOD1 estaria envolvida com casos de ELA esporádicos, mais comumente encontrados, e nossa proposta está relacionada a alterações no sítio de ligação ao zinco na enzima, levando a agregações proteicas e formas agressivas da doença. Portanto neste projeto de Doutorado pretendemos estudar algumas mutações sítio dirigidas na SOD1, em continuidade ao projeto de mestrado (FAPESP,2010/12817-3, finalizado em 03/2013) especificamente no sítio complexante de zinco, e verificar como a enzima se comporta cataliticamente e estruturalmente, e estudar a influência destas mutações em relação a: I) atividade peroxidásica da SOD1; II) agregação proteica da SOD1 em células. Para isso, as etapas do trabalho serão: 1) construção das mutações via PCR, onde a estrutura da enzima seja estabilizada, em sistemas adequados para expressão da enzima em grandes quantidades em bactérias; 2) expressão e isolamento da(s) hSOD1 mutada (hSOD1mut); 3) estudo da atividade catalítica normal da(s) hSOD1mut e estudo de sua estrutura através de Espectroscopia paramagnética eletrônica (EPR) para verificação do sítio de cobre e através de Dicroísmo Circular, para verificação das estruturas secundárias proteicas; 4) Estudos de atividade peroxidásica e de agregação proteica ao inserir as proteínas mutadas em células de mamíferos, via expressão gênica; 5) Cristalização da(s) hSOD1 mutada. (AU)

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