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Desvendando o papel das DNA polimerases da família Y na mutagênese em C. crescentus usando novas ferramentas genéticas e sequenciamento de genomas

Processo: 13/04242-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Vigência (Início): 01 de abril de 2013
Vigência (Término): 30 de setembro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Rodrigo da Silva Galhardo
Beneficiário:Alexy Orozco Valencia
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:09/51387-7 - Regulação da mutagênese no modelo de Caulobacter crescentus e suas implicações para a evolução bacteriana, AP.JP
Assunto(s):Caulobacter crescentus   Genômica   Mutagênese   Reparo do DNA

Resumo

Este projeto tem por objetivo desenvolver experimentos que visam aprofundar os conhecimentos sobre os processos de geração de variabilidade genética em bactérias, utilizando nosso modelo de estudo, a alfa-proteobactéria Caulobacter crescentus. Nosso interesse particular reside no papel das DNA polimerases de baixa fidelidade, que atuam na via de síntese translesão. Dentre estas polimerases especializadas, Caulobacter crescentus possui o gene dinB e o operon imuABdnaE2, e é de nosso interesse desvendar o papel de ambas na mutagênese espontânea, e naquela induzida por vários agentes genotóxicos. Dentro deste contexto, desenvolvemos recentemente um novo marcador para estudos de mutagênese nesta bactéria, ao qual denominamos xylbla. Durante o último ano, realizamos diversos experimentos com este marcador, e demonstramos que dinB está envolvido na formação espontânea de frameshifts em C. crescentus, enquanto que a polimerase DnaE2 possui um papel protetor da integridade genética, atuando em síntese translesão livre de erro em lesões endógenas. Entretanto, detectamos que existem duas classes diferentes de mutações detectadas com o marcador xylbla: mutações no gene xylR, onde predominam os frameshifts e as substituições A:T G:C, e as mutações no promotor PxylX, onde predominam as transições G:C A:T. Devido à natureza distinta dessas mutações, é de nosso interesse refazer os experimentos com este marcador, determinando separadamente as taxas de mutação em xylR e PxylX. Assim, um dos objetivos deste projeto é realizar tais experimentos, bem como determinar o espectro de mutação em PxylX e xylR para cada uma das cepas de interesse. Outra abordagem que nosso laboratório vem desenvolvendo mais recentemente é o uso de sequenciamento em larga escala para detectar mutações em todo o genoma, desta forma obtendo um panorama mais realista da dinâmica do processo de mutagênese no cromossomo bacteriano. Em primeiro lugar, propusemos analisar a mutagênese induzida por UV em C. crescentus, tanto aquela dependente de ImuAB DnaE2, quanto aquele que independe destas proteínas. Realizamos uma primeira etapa de sequenciamento, onde apesar de termos obtidos dados com cobertura muito aquém do desejável, já possuímos listas de potenciais SNPs introduzidos em cada cepa por luz UV. Estas listas estão sendo analisadas, e é nosso objetivo confirmar alguns destes SNPS por PCR e sequenciamento convencional para avaliar a robustez do método de detecção. Ademais, iremos realizar uma nova rodada de sequenciamento, nestes e em outros isolados obtidos. Assim, outro objetivo deste projeto é a confirmação dos SNPs observados através de sequenciamento Sanger. (AU)