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Caracterização bioquímica de novas variantes de ²-lactamases de espectro estendido (ESBL) identificadas em São Paulo, SP, Brasil

Processo: 13/07943-8
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Pesquisa
Vigência (Início): 05 de agosto de 2013
Vigência (Término): 04 de dezembro de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
Pesquisador responsável:Milena Dropa
Beneficiário:Milena Dropa
Anfitrião: Pablo Power
Instituição-sede: Faculdade de Saúde Pública (FSP). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : Universidad de Buenos Aires (UBA), Argentina  
Assunto(s):Saúde pública   beta-Lactamases

Resumo

A resistência bacteriana é um problema mundial de saúde pública, facilitado pela pressão seletiva do uso de antimicrobianos na clínica e em outras atividades. As ²-lactamases de espectro estendido (ESBL) são uma das formas mais prevalentes de resistência em Gram negativos no mundo, e devido à frequência das mutações pontuais ocorridas nessas enzimas, há uma grande facilidade de surgimento de novas variantes enzimáticas, podendo implicar em novos perfis de resistência aos antimicrobianos ²-lactâmicos. Justificativa: a descoberta de duas novas variantes de ESBL em cepas hospitalares de um recente estudo mostra que, além do problema mundial de disseminação de genes de resistência, a pressão seletiva de antimicrobianos exercida sobre as bactérias pode possibilitar o surgimento de enzimas com atividade hidrolítica mais ampla. Portanto, as propriedades bioquímicas das novas variantes enzimáticas necessitam ser devidamente caracterizadas. Objetivo: caracterizar bioquimicamente as novas variantes de ESBL TEM-197 e CTX-M-131. Material e Métodos: os genes codificadores das novas enzimas, identificados em um estudo prévio, serão clonados em um sistema de expressão, e os clones serão submetidos à medida da concentração inibitória mínima por meio de Etest, extração de enzimas por congelamento (-20ºC) e descongelamento (20ºC), e purificação das mesmas em coluna de troca iônica conectada a um purificador. As frações ativas da enzima serão detectadas por sistema iodométrico, e o grau de purificação das amostras será verificado por SDS-PAGE. O ponto isoelétrico das enzimas será determinado por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida, a atividade hidrolítica por espectrofotometria utilizando nitrocefin como substrato, e a massa molecular será determinada por HPLC com espectrometria de massa. Os parâmetros cinéticos - constantes Km e kcat, bem como a relação kcat/Km (eficiência catalítica), serão medidos para cada composto b-lactâmico, pela variação de absorbância em espectrofotômetro. Resultados Esperados. Espera-se que a caracterização bioquímica das novas enzimas forneça informações técnicas e epidemiológicas relevantes para a comunidade científica, e que as técnicas utilizadas neste projeto possam ser implantadas futuramente no Brasil. (AU)

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
DROPA, MILENA; GHIGLIONE, BARBARA; MATTE, MARIA HELENA; BALSALOBRE, LIVIA CARMINATO; LINCOPAN, NILTON; MATTE, GLAVUR ROGERIO; GUTKIND, GABRIEL; POWER, PABLO. Molecular and Biochemical Characterization of CTX-M-131, a Natural Asp240Gly Variant Derived from CTX-M-2, Produced by a Providencia rettgeri Clinical Strain in Sao Paulo, Brazil. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 59, n. 3, p. 1815-1817, MAR 2015. Citações Web of Science: 3.

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