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Otimização de ensaio reparo in vitro de quebras de duplas fitas usando extratos mitocondriais e nucleares

Processo: 13/12011-7
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2013
Vigência (Término): 30 de novembro de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Nadja Cristhina de Souza Pinto
Beneficiário:Valquiria Tiago dos Santos
Supervisor no Exterior: Dianov Grigory
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Local de pesquisa : University of Oxford, Inglaterra  
Vinculado à bolsa:10/18254-0 - Estudo dos mecanismos moleculares do reparo de quebra de duplas fitas no DNA mitocondrial, BP.DR
Assunto(s):DNA

Resumo

O DNA mitocondrial esta fisicamente associado à face interna da membrana interna da mitocôndria, onde são geradas grandes quantidades de espécies reativas a oxigênio. Esse contínuo ataque dessas espécies reativas pode causar várias alterações que incluem oxidações de bases e do açucar, ligações cruzadas entre DNA e proteínas, além de quebras de fita simples e de fita dupla. Quebras de fita dupla são especialmente toxicas ao organismo pois, quando não levam a perda da informação genética, parada da replicação e a consequente morte celular. No núcleo, quebras de fita dupla no DNA podem ser reparadas através de dois mecanismos distintos: ligação de pontas não homólogas (NHEJ) e recombinação homóloga (HR). Enquanto as vias de NHEJ e HR no núcleo estão bem descritas, o nosso conhecimento sobre a atuação desses mecanismos no reparo em mtDNA ainda é bem limitado. Diferentes grupos tem atuado nesse sentido, e através do uso de estratégias tanto in vivo quanto in vitro obtiveram algumas evidências sobre a existência de mecanismos que reparam quebras de duplas fitas em mitocôndrias de células de mamíferos. Essas evidências são fundamentadas, entre outros, por experimentos in vitro utilizando plasmídeos contendo extremidades livres devido a clivagem com enzima de restrição, cuja religação ocorreu após a incubação com extratos mitocondriais. As proteínas responsáveis por tais atividades não são conhecidas. Os resultados obtidos até o momento neste projeto mostram claramente que proteínas envolvidas em NHEJ (Ku, DNA-PKCs) e HR (ATM, Rad51 e Rad52) no núcleo também estão localizadas nas mitocôndrias, o sugere que as mesmas são responsáveis pelas atividades observadas nos experimentos com extratos mitocondriais. Nesse sentido pretendemos fazer uso desse ensaio, com extratos mitocondriais das linhagens normais e de linhagens knockdown para cada gene estudado (Rad51, Rad52, Ku, DNA-PKCs, ATM). Essa abordagem in vitro irá determinar se estas proteínas estão envolvidas nesse reparo, e nos permitira realizar estudos cinéticos e de interação proteica entre os componentes das vias de reparo de quebras de fita dupla. As linhagens knockdown para cada gene estudado já foram construídas e verificadas, assim como as proteínas já foram identificadas nas mitocôndrias. Mesmo com etapas anteriores já cumpridas, até o presente momento não conseguimos responder se as proteínas que identificamos são responsáveis pela atividade de reparo observada, uma vez que ainda não conseguimos padronizar o ensaio funcional. Utilizando os protocolos descritos na literatura e modificações sugeridas, várias tentativas foram realizadas, como descritas nos relatórios de atividade submetidos à FAPESP, mas até o presente momento não obtivemos sucesso. Desta forma, e diante da importância desse ensaio funcional para a inequívoca determinação do papel dessas proteínas no reparo de quebras em mtDNA, propomos a elaboração desse estágio que possui como objetivo principal a padronização do ensaio de reparo de quebras de duplas fitas usando extratos mitocondriais e nucleares. (AU)