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Análise proteômica de Leishmania mexicana por permeabilização de diferentes membranas celulares com digitonina

Processo: 13/11509-1
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 13 de agosto de 2013
Vigência (Término): 12 de dezembro de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Marcia Aparecida Silva Graminha
Beneficiário:Camila Tita Nogueira
Supervisor no Exterior: Michael Louis Ginger
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCFAR). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
Local de pesquisa : Lancaster University, Inglaterra  
Vinculado à bolsa:11/06995-9 - Busca de antígenos para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina: caracterização das proteínas tr 06 e 36, BP.DR
Assunto(s):Digitonina   Biologia molecular   Leishmania mexicana

Resumo

As leishmanioses são um grupo de doenças causa pelo gênero Leishmania. Essas colocam em risco 350 milhões de pessoas no mundo nas suas duas principais formas, a leishmaniose cutânea e a leishmaniose visceral.Após o sequenciamento completo do genoma de Leishmania major e o avanço no sequenciamento de outras espécies (Leishmania braziliensis, L. mexicana e L. infantum), muito se tem avançado a respeito do estudo proteômico de suas formas (amastigotas e promastigotas) a fim de conhecer melhor a interação parasito - hospedeiro, trazendo importantes informações sobre a biologia básica destes organismos, com potencial aplicação no aperfeiçoamento ou desenvolvimento de técnicas diagnósticas e terapêuticas, evitando-se, assim, reações cruzadas ou falhas no tratamento devido a intricados mecanismos de resistência, respectivamente.Desta forma, este projeto visa treinamento na técnica de fracionamento subcelular por permeabilização celular por digitonina, na qual é possível, por meio de técnicas de immunoblotting, caracterizar proteínas em estudo quanto às suas localizações nos diferentes compartimentos subcelulares, constituindo-se em informações importantes sobre função das mesmas na célula. Tal abordagem metodológica será aplicada no projeto de pesquisa de doutorado (processo FAPESP n. 2011/06995-9) visando caracterização funcional dos genes em estudo, além de aplicação direta da mesma nos diferentes projetos de pesquisa do laboratório relacionados com a compreensão de mecanismo de ação de novos compostos com atividade leishmanicida.O objetivo é introduzir a bioquímica e abordagens biológicas de (i) fracionamento celular por extração com digitonina e (ii) microscopia de fluorescência para estudar a localização de proteínas (e suas funções) em tripanosomatideos, estudando a função da adenilato quinase, bem como a dinâmica do citoesqueleto em Leishmania. A adenilato quinase faz parte de uma grande família em tripanosomatideos com produtos de genes localizados em uma variedade de compartimentos subcelulares, como mitocôndria, citosol, glicossomos, núcleo e flagelo (onde diferentes isoformas são encontradas seletivamente no axonema ou na haste paraflagelar). Dentro desses compartimentos, a função de homeostase de nucleotídeos fornecida pela adenilato quinase desempenha uma série de papéis na motilidade da célula e na gestão de energia (J. Biol Chem 280: 11781-9; trabalho em preparação). O objetivo é usar o fracionamento de digitonina para determinar a localização sub-organelar de uma adenilato quinase mitocondrial essencial e usar microscopia de fluorescência para estudar a expressão de ciclo de vida em Leishmania. Esta isoforma é seletivamente up-regulated em estágios específicos do ciclo de vida e a análise de células de parasitas, expressando a proteína verde fluorescente (GFP) marcada com adenilato quinase de um locus endógeno fornece oportunidade para não só testar essa hipótese, mas também aprender a técnica de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) para estudar o volume de proteínas e a mobilidade dos complexos das mesmas dentro de células de parasitas da família Trypanosomatidae. (AU)

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