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Análise proteômica de Leishmania mexicana por permeabilização de diferentes membranas celulares com digitonina

Processo: 13/11509-1
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 13 de agosto de 2013
Vigência (Término): 12 de dezembro de 2013
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Marcia Aparecida Silva Graminha
Beneficiário:Camila Tita Nogueira
Supervisor no Exterior: Michael Louis Ginger
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCFAR). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
Local de pesquisa: Lancaster University, Inglaterra  
Vinculado à bolsa:11/06995-9 - Busca de antígenos para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina: caracterização das proteínas TR 06 e 36., BP.DR
Assunto(s):Digitonina   Leishmania mexicana

Resumo

As leishmanioses são um grupo de doenças causa pelo gênero Leishmania. Essas colocam em risco 350 milhões de pessoas no mundo nas suas duas principais formas, a leishmaniose cutânea e a leishmaniose visceral.Após o sequenciamento completo do genoma de Leishmania major e o avanço no sequenciamento de outras espécies (Leishmania braziliensis, L. mexicana e L. infantum), muito se tem avançado a respeito do estudo proteômico de suas formas (amastigotas e promastigotas) a fim de conhecer melhor a interação parasito - hospedeiro, trazendo importantes informações sobre a biologia básica destes organismos, com potencial aplicação no aperfeiçoamento ou desenvolvimento de técnicas diagnósticas e terapêuticas, evitando-se, assim, reações cruzadas ou falhas no tratamento devido a intricados mecanismos de resistência, respectivamente.Desta forma, este projeto visa treinamento na técnica de fracionamento subcelular por permeabilização celular por digitonina, na qual é possível, por meio de técnicas de immunoblotting, caracterizar proteínas em estudo quanto às suas localizações nos diferentes compartimentos subcelulares, constituindo-se em informações importantes sobre função das mesmas na célula. Tal abordagem metodológica será aplicada no projeto de pesquisa de doutorado (processo FAPESP n. 2011/06995-9) visando caracterização funcional dos genes em estudo, além de aplicação direta da mesma nos diferentes projetos de pesquisa do laboratório relacionados com a compreensão de mecanismo de ação de novos compostos com atividade leishmanicida.O objetivo é introduzir a bioquímica e abordagens biológicas de (i) fracionamento celular por extração com digitonina e (ii) microscopia de fluorescência para estudar a localização de proteínas (e suas funções) em tripanosomatideos, estudando a função da adenilato quinase, bem como a dinâmica do citoesqueleto em Leishmania. A adenilato quinase faz parte de uma grande família em tripanosomatideos com produtos de genes localizados em uma variedade de compartimentos subcelulares, como mitocôndria, citosol, glicossomos, núcleo e flagelo (onde diferentes isoformas são encontradas seletivamente no axonema ou na haste paraflagelar). Dentro desses compartimentos, a função de homeostase de nucleotídeos fornecida pela adenilato quinase desempenha uma série de papéis na motilidade da célula e na gestão de energia (J. Biol Chem 280: 11781-9; trabalho em preparação). O objetivo é usar o fracionamento de digitonina para determinar a localização sub-organelar de uma adenilato quinase mitocondrial essencial e usar microscopia de fluorescência para estudar a expressão de ciclo de vida em Leishmania. Esta isoforma é seletivamente up-regulated em estágios específicos do ciclo de vida e a análise de células de parasitas, expressando a proteína verde fluorescente (GFP) marcada com adenilato quinase de um locus endógeno fornece oportunidade para não só testar essa hipótese, mas também aprender a técnica de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) para estudar o volume de proteínas e a mobilidade dos complexos das mesmas dentro de células de parasitas da família Trypanosomatidae. (AU)

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