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Análise do papel da Thr44 de Tsa1 de Saccharomyces Cerevisiae na catálise de hidroperóxidos, interação com Trx, oligomerização e processo de superoxidação

Processo: 13/16192-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de setembro de 2013
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Melina Cardoso dos Santos
Instituição-sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/07937-8 - Redoxoma, AP.CEPID
Assunto(s):Espécies de oxigênio reativas

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) 2-Cys típicas são proteínas antioxidantes distribuídas universalmente entre os organismos e presentes em vários compartimentos celulares. Apesar de seu papel protetor para a célula, em eucariotos multicelulares já foi demonstrado que estas enzimas estão relacionadas a diversos tipos de cânceres, uma vez que são capazes de manter os níveis de hidroperóxidos em quantidades suficientes para permitir o crescimento celular, mas não para permitir a apoptose. As Prx 2-Cys típicas são capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos utilizando um resíduo de cisteína denominado cisteína peroxidásica (CP) que, após a redução do substrato, é oxidado a ácido sulfênico (CP-SOH). As Prx 2-Cys típicas são dímeros obrigatórios e possuem um segundo resíduo de cisteína envolvido no ciclo catalítico chamado de cisteína de resolução (CR-SH), o qual forma um dissulfeto intermolecular com a CP do monômero adjacente durante o processo de decomposição de peróxidos. Estas enzimas apresentam uma alta reatividade sobre hidroperóxidos (~107 M-1s-1) que está relacionada à manutenção da CP na forma de tiolato (S-) por um resíduo de Thr (ou Ser, em alguns casos) e um de Arg, os quais se acredita serem capazes de estabilizar CP na forma de S- diminuindo seu pKa, além de possuírem um papel fundamental no posicionamento e estabilização do hidroperóxido no sítio ativo, permitindo que a CP execute uma reação de substituição SN2 na catálise. Estes três resíduos, denominados de tríade catalítica, são amplamente conservados em todas as Prx descritas até o momento A maior parte das Prx utiliza tiorredoxina (Trx) como substrato redutor. O NADPH, por sua vez, reduz a Trx em reação catalisada pela tiorredoxina redutase (TrxR). Em altas concentrações de hidroperóxidos, a CP das Prx 2-Cys de eucariotos pode ser superoxidada a cisteína ácido sulfínico (CP-SO2H) que resulta em um grande rearranjo estrutural da enzima ocasionando um processo de transição funcional peroxidase® chaperona envolvido na transdução de sinal por hidroperóxidos. Em Saccharomyces cerevisiae, a Prx Tsa1 destaca-se pela abundância (~380.000 moléculas por célula na fase log de crescimento) podendo ainda, quando superoxidada, apresentar atividade de chaperona molecular. Em projeto anterior, foram obtidas proteínas mutantes carreando a substituição do resíduo da Thr44 da tríade catalítica em Tsa1 de S. cerevisiae por aminoácidos de características físico-químicas distintas (Ser, Ala e Val) e foi avaliada a reatividade da proteína sobre hidroperóxidos e interação com a Trx. Este projeto tem por objetivo, dar continuidade ao projeto anterior, avaliando os efeitos das substituições sobre o pKa de CP, no processo de superoxidação e conseqüente transição funcional peroxidase-chaperona, avaliação dos efeitos das mutações sobre a estrutura secundária e quaternária através das metodologias envolvendo espectroscopia de dicroísmo circular (CD), cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Adicionalmente, serão efetuadas triagens e refinamentos de condições de cristalização de Tsa1T44A com o intuito de se determinar a estrutura cristalográfica da enzima. De forma geral, acreditamos que os resultados gerados neste projeto poderão contribuir de forma bastante significativa para um melhor entendimento dos mecanismos de catálise, interação com o sistema redutor e superoxidação das Prx 2-Cys típicas.