Estudos biofísicos e estruturais da hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus, e das suas subunidades monômero d e dodecâmero (abcd)3.

• Processo: 13/09829-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de janeiro de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de maio de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Marcel Tabak
• Beneficiário: Francisco Adriano de Oliveira Carvalho
• Instituição Sede: Instituto de Química de São Carlos (IQSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Tensoativos Hemoglobinas Dissociação
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: cloridrato de guanidina e ureia | desnaturação | Dissociação | HbGp | hemoglobina | surfactantes | Espectroscopias óticas, Ultracentrifugação Analítica, Espalhamento de luz e Dicroísmo Circular.

Resumo

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) tem uma massa molecular de 3,6 MDa determinada por ultracentrifugação analítica. A HbGp apresenta alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. Esta classe de proteínas apresenta um potencial promissor em aplicações biomédicas como, por exemplo, como substituto sanguíneo. Neste sentido, as hemoglobinas de anelídeos são objeto de estudos em vários grupos de pesquisas no mundo. Estudos de ultracentrifugação analítica mostraram que a HbGp dissocia-se em pH alcalino, na presença de surfactantes e de ureia, originando subunidades menores, tais como o dodecâmero, tetrâmero, trímero e monômero d. Estudos recentes mostram que a interação HbGp-surfactante induz vários processos conformacionais, tais como, agregação, dissociação oligomérica e desnaturação. Por outro lado, a estabilidade oligomérica está fortemente relacionada com o estado de oxidação do ferro e com o ligante coordenado no centro metálico. Assim, o presente projeto de pós-doutorado propõe estudar os processos cinéticos e termodinâmicos de dissociação e desnaturação de HbGp na presença da ureia e do cloridrato de guanidina. Adicionalmente, estudos sobre o desenovelamento térmico de HbGp na presença de pequenas concentrações de ureia e de cloridrato de guanidina serão realizados por várias técnicas espectroscópicas e hidrodinâmicas com o objetivo de aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos de desnaturação desta proteína na presença destes agentes, bem como sobre a estequiometria das subunidades no oligômero, e da estabilidade da proteína nativa em diferentes condições. Esse estudo comparativo do efeito de dois agentes desnaturantes com características físico-químicas diferentes, um neutro (ureia) e outro carregado (catiônico, cloridrato de guanidina) irá possibilitar a avaliação da contribuição da interação eletrostática no sistema proteína-desnaturante. Além disso, no intuito de compreender melhor a interação proteína-surfactante, este projeto propõe caracterizar os principais sítios de ligação do SDS e CTAC na subunidade monomérica d, através de técnicas de cristalização e modelagem molecular por homologia. Os ensaios de modelagem molecular com o tetrâmero abcd, o trímero abc, o monômero d e o dodecâmero (abcd)3 serão desenvolvidos, a fim de caracterizar tanto as interações entre os surfactantes e estas subunidades, quanto os contatos entre as subunidades na estrutura oligomérica da HbGp. Estes estudos serão realizados em concentrações sub-milimolares de surfactantes, adequadas para avaliar a associação dos mesmos à proteína sem promover uma desnaturação extensa. Para alcançar estes objetivos propõe-se o uso de técnicas de cristalização e modelagem molecular por homologia, bem como, espectroscópicas e hidrodinâmicas, tais como a absorção óptica, o dicroísmo circular, DLS, RPE e ultracentrifugação analítica.

Publicações científicas

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(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

CARVALHO, FRANCISCO A. O.; ALVES, FERNANDA R.; CARVALHO, JOSE W. P.; TABAK, MARCEL. Guanidine hydrochloride and urea effects upon thermal stability of Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp). International Journal of Biological Macromolecules, v. 74, p. 18-28, MAR 2015. (11/09863-6, 13/09349-6, 13/09829-8)

CARVALHO, FRANCISCO A. O.; ALVES, FERNANDA R.; TABAK, MARCEL. Ionic surfactants-Glossoscolex paulistus hemoglobin interactions: Characterization of species in the solution. International Journal of Biological Macromolecules, v. 92, p. 670-681, NOV 2016. (13/09829-8)

ALVES, FERNANDA ROSA; CARVALHO, FRANCISCO ADRIANO O.; CARVALHO, JOSE WILSON P.; TABAK, MARCEL. Interaction of Cationic Dodecyl-trimethyl-Ammonium Bromide with Oxy-HbGp by Isothermal Titration and Differential Scanning Calorimetric Studies: Effect of Proximity of Isoelectric Point. Biopolymers, v. 105, n. 4, p. 199-211, APR 2016. (13/09829-8)

CARUSO, CELIA S.; BIAZIN, EZER; CARVALHO, FRANCISCO A. O.; TABAK, MARCEL; BACHEGA, JOSE F. R.. Metals content of Glossoscolex paulistus extracellular hemoglobin: Its peroxidase activity and the importance of these ions in the protein stability. Journal of Inorganic Biochemistry, v. 161, p. 63-72, AUG 2016. (13/09829-8)

ALVES, FERNANDA ROSA; CARVALHO, FRANCISCO ADRIANO O.; CARVALHO, JOSE WILSON P.; TABAK, MARCEL. Glossoscolex paulistus Extracellular Hemoglobin (HbGp) Oligomeric Dissociation upon Interaction with Sodium Dodecyl Sulfate: Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Biopolymers, v. 101, n. 10, p. 1065-1076, OCT 2014. (11/09863-6, 13/09349-6, 13/09829-8)

BARROS, ANA E. B.; CARVALHO, FRANCISCO A. O.; ALVES, FERNANDA R.; CARVALHO, JOSE W. P.; TABAK, MARCEL. Denaturant effects on HbGp hemoglobin as monitored by 8-anilino-1-naphtalene-sulfonic acid (ANS) probe. International Journal of Biological Macromolecules, v. 74, p. 327-336, MAR 2015. (11/09863-6, 13/09829-8)