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Técnicas laboratoriais para a análise da ADAM10 sináptica na Doença de Alzheimer

Processo: 13/19521-0
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Vigência (Início): 01 de maio de 2014
Vigência (Término): 31 de julho de 2014
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Márcia Regina Cominetti
Beneficiário:Patricia Regina Manzine Moralles
Supervisor no Exterior: Monica M. G. DiLuca
Instituição-sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Local de pesquisa : Università degli Studi di Milano, Itália  
Vinculado à bolsa:12/08654-7 - Biomarcadores sanguíneos para a Doença de Alzheimer: avaliação da expressão gênica da ADAM10 e de micro-RNAs, BP.DR
Assunto(s):Doença de Alzheimer   Idosos

Resumo

A Proteína Precursora de Amilóide (APP) tem sido o centro de intensas pesquisas nos últimos anos devido sua associação com a patogênese da doença de Alzheimer (DA). Na via não amiloidogênica, a APP é clivada pela A Disintegrin And Metallopeptidase 10 (ADAM10), uma ±-secretase, entre Lisina16 e Leucina17 no meio da região do ²-amilóide (A²), deste modo, liberando a sAPP± - uma estrutura com funções neurotrópica e neuroprotetora - retendo o resíduo C83 na membrana. A clivagem seguinte do C83 pela ³-secretase libera o p3 - que é supostamente benéfico e não é encontrado nas placas amilóides - com início na posição A²17 (A²17-40 e A²17-42), inibindo assim a produção do A² amiloidogênico. O Laboratório de Farmacologia da Neurodegeneração (LFN) do Departamento de Ciências Farmacológicas - UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO (UNIMI) atua na investigação da expressão de proteínas sinápticas em neurônios, entre elas a ADAM10, assim como na modulação de sua expressão a partir de outras proteínas carreadoras. Duas linhas de pensamento norteiam os estudos sobre a expressão da ADAM10 em neurônios, ambas relacionadas com o tráfico intraneuronal desta proteína. A primeira direciona-se ao estudo da proteína 97 associada à sinapse (SAP97), a qual em associação com a ADAM10 favorece seu tráfico citoplasmático em direção à membrana, de modo que ativa sua capacidade proteolítica da APP, como ±-secretase. A segunda é focada sobre aspectos da endocitose da ADAM10 de membrana, realizada pela proteína adaptadora de Clatrina (AP2). Esta combinação promove a internalização da ADAM10 e, portanto, influência sua expressão e atividade como ±-secretase. Para o desenvolvimento destes estudos técnicas laboratoriais para análise proteica como: western blotting, imunoprecipitação, eletroforese bidimensional em gel, etc.; técnicas in vitro e in vivo para análise de fosforilação proteica; fracionamento subcelular; cultura celular e de fragmento; transfecção; microscopia confocal; biologia molecular: PCR, RT-qPCR, clonagem; cultura de tratamento neuronal, co-imunoprecipitação, co-localização, ação da potenciação/depressão de longa duração (LTP e LTD respectivamente) na plasticidade neuronal e sequenciamento genético da cauda citoplasmática da ADAM10 (ADAM10 Ct) foram realizados. Dado que o UNIMI destaca-se como centro de excelência no estudo da ADAM10 plaquetária e neuronal, este estágio irá representa uma importante colaboração com o intuito de estabelecer uma nova área de pesquisa no nosso laboratório (LABEN), direcionada ao estudo da ADAM10 neuronal utilizando algumas das técnicas que serão objetivo deste estágio. O principal objetivo é incorporar conhecimentos teórico-práticos sobre as técnicas laboratoriais realizadas pelo LFN-UNIMI no estudo da expressão neuronal da ADAM10 visando padronizar e implementar tais técnicas no LABEN. O contato com técnicas laboratoriais permitirá um aprimoramento nas formas de análise e avaliação dos materiais biológicos, em especial sangue periférico e neurônios. Este estágio poderá fornecer as bases para o desenvolvimento de futuros estudos no nosso grupo de pesquisa, os quais poderão utilizar das novas metodologias laboratoriais com o intuito de aprofundar e avaliar outros materiais biológicos de sujeitos controles, com comprometimento cognitivo leve (CCL) e pacientes com DA. Espera-se que os achados obtidos até o momento, referentes à expressão gênica da ADAM10 em idosos com doença de Alzheimer do projeto de doutorado (Processo n°2012/08654-7) possam ser comparados com estudos que estão em desenvolvimento pelo LFN-UNIMI, estabelecendo-se assim um estudo colaborativo. Durante o período de três meses do estágio, pretende-se acompanhar e aprender as técnicas laboratoriais para avaliação da expressão da ADAM10 neuronal: sequenciamento genético dos diferentes domínios da ADAM10; tratamento de cultura neuronal (LTP e LTD), biotinilação de superfície, ensaios crosslinking, de internalização, co-localização e co-imunoprecipitação. (AU)