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Promotores constitutivos de Citrus sinensis: isolamento e avaliação de sua eficiência na expressão do gene uidA (GUS) em Solanum lycopersicum e Citrus sinensis

Processo: 13/19700-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2013
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2017
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Agronomia - Fitotecnia
Pesquisador responsável:Beatriz Madalena Januzzi Mendes
Beneficiário:Lígia Erpen
Instituição-sede: Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):14/25077-9 - Caracterização dos elementos regulatórios em promotores de citros, BE.EP.DR
Assunto(s):Citrus   Transformação genética

Resumo

A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional, permitindo a introdução de genes que podem influenciar a resistência de plantas a doenças. O método mais utilizado para transformação genética de citros é Agrobacterium tumefaciens. Neste método, o T-DNA, contendo o gene de interesse dirigido por um promotor, é transferido para a planta. Entre os promotores usualmente empregados, destaca-se o promotor constitutivo CaMV35S, isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor, com capacidade de induzir forte expressão do transgene. No entanto, novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia) implicam na utilização de material genético derivado da própria espécie ou de espécies relacionadas. Nesse sentido, há uma demanda por promotores constitutivos nativos de citros. Assim, o objetivo do trabalho é identificar e isolar promotores constitutivos de Citrus sinensis como alternativa ao promotor CaMV35S. Para isso, serão identificados genes constitutivos com forte expressão no genoma de Citrus sinensis. A região promotora desses genes será isolada e inserida em um cassete de expressão para controlar o gene repórter uidA (GUS). A eficiência dos promotores isolados será avaliada após transformação genética da planta modelo Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom e de C. sinensis cv. Hamlin. A transformação será via A. tumefaciens, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201 com o cassete de expressão com os promotores constitutivos de C. sinensis ou o promotor CaMV35S, associados ao gene repórter uidA (GUS). A identificação de plantas transgênicas será realizada pelo ensaio histoquímico GUS e análise de PCR e a confirmação da integração do transgene será feita pela análise de Southern Blot. As regiões cis-reguladoras presentes em cada promotor serão caracterizadas in silico. A eficiência dos promotores constitutivos de C. sinensis, na expressão do gene repórter uidA (GUS), será avaliada e comparada a eficiência do promotor CaMV35S pela análise de RT-qPCR.